2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
蒙脱石为膨润土矿主要成分，其层纹状结构和非均匀性电荷分布，对消化道内的病毒、病菌及其产生的毒素等具有极强的固定、吸附作用，使病毒、病菌等失去致病作用；此外蒙脱石通过覆盖消化道黏膜发挥防御功能，具有平衡正常菌群和局部止痛作用，适用于成人及儿童急、慢性腹泻[1]。蒙脱石及其制剂的现行质量标准收载于中国药典2015年版二部[2]，其中吸附力检查是唯一反映蒙脱石吸附能力的检验项目。吸附力的结果直接反映药品的疗效，多年来该项检查需使用硫酸士的宁作为标志物，但硫酸士的宁属于A级有机毒性物质，在使用的同时会对环境造成污染，操作不慎还可能导致实验人员被毒物污染，存在很大的安全隐患。同时，国内尚无硫酸士的宁的生产企业，蒙脱石生产企业需长期进口该试剂，价格昂贵，无形中增加了企业成本。此次根据研究结果，采用三氯六氨合钴（Ⅲ）作为吸附力测定标志物，该试剂无毒，易得，性质稳定，经方法学验证及21家生产企业共39批原料及其制剂的试验复核，本品可替代硫酸士的宁用于测定蒙脱石吸附力，并提出对蒙脱石及其制剂吸附力测定方法进行修订。
1 理论论证 1.1 吸附力测定原理蒙脱石为硅氧四面体和铝氧八面体组成的双八面体层状结构，结构通式为（K，Na，Ca，Mg）y（Al，Mg）2（Si，Al）4O10（OH）2·xH2O，其中（K，Na，Ca，Mg）y为层间可交换阳离子，（Al，Mg）2为八面体中的阳离子，（Si，Al）4为四面体中的阳离子，结构中的Al和Mg对Si和Al的随机取代造成电荷的不平衡，使其具有带电性和离子交换的特性[3-4]。蒙脱石吸附力无法直接测定，但可通过其选择性吸附、交换某些阳离子而间接测定。以硫酸士的宁作为标志物测定吸附力的原理为硫酸士的宁分子具有紫外吸收，当被蒙脱石吸附后紫外吸收消失，因此可使蒙脱石与过量的硫酸士的宁充分反应，利用剩余硫酸士的宁的量推算出蒙脱石的吸附力[5]，其中蒙脱石与硫酸士的宁反应过程如图 1-A、B。
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图 1 蒙脱石与硫酸士的宁的反应过程（A）及结果（B） Figure 1 The reaction procedure(A)and the reaction result of montmorillonite and strychninesulfate |
由图 1可知，硫酸士的宁中的阳离子可与蒙脱石分子层间的K+、Na+、Ca2+、Mg2+等阳离子发生交换，从而被吸附在蒙脱石分子中。在矿产行业通常采用三氯六氨合钴（Ⅲ）测定膨润土矿（提纯后得到蒙脱石）的阳离子交换容量，这一反应与吸附力的测定具有相同的反应机理，即蒙脱石层间阳离子与三氯六氨合钴（Ⅲ）分子中的钴铵阳离子发生交换，钴铵阳离子结合在蒙脱石分子中并使其颜色消失，通过测定剩余量的三氯六氨合钴（Ⅲ）推算出阳离子交换容量[6-9]。
1.2 三氯六氨合钴（Ⅲ）简介本品性状为黄色或橙黄色结晶，英文名为hexaamminecobalt（Ⅲ）chloride，CAS号为10534-89-1。三氯六氨合钴（Ⅲ）是由1个[Co（NH3）6]3+阳离子和2个Cl-组成的经典配合物，钴（Ⅲ）处于阳离子八面体中心（结构见图 2），[Co（NH3）6]3+为稳定的配离子，常温时遇强酸和强碱基本不分解。
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图 2 [Co（NH3）6]3+阳离子立体结构 Figure 2 3D structure of [Co(NH3)6]3+ |
三氯六氨合钴（Ⅲ）与硫酸士的宁分别与蒙脱石反应时，两者存在换算系数，即当前者测定蒙脱石吸附力为1 mmol·g-1时，后者测定吸附力为0.43 g·g-1。换算过程如下：
0.43 g·g-1→1 mmol·g-1（折算硫酸士的宁的摩尔质量432.419 g·mol-1）。
综上所述三氯六氨合钴（Ⅲ）可替代硫酸士的宁作为蒙脱石吸附力测定的标志物。
2 吸附力测定 2.1 仪器与试药岛津UV-2450分光光度计、普析T9分光光度计、Thermo EVOLUTION 300 U-VIS分光光度计；METTLER XSE205天平、METTLER AE240天平；水为去离子水。三氯六氨合钴（Ⅲ）均为化学试剂，生产企业、批号及纯度见表 1。
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表 1 三氯六氨合钴（Ⅲ）生产企业及纯度情况 Table 1 The production and purity of Hexaamminecobalt(Ⅲ)chloride |
蒙脱石原料样品分别为博福-益普生（天津）制药有限公司（批号E16061-BBNo1、E16063-BBNo1、E16062-BBNo3）、浙江海力生制药有限公司（批号140502、140614、140615）、先声药业有限公司（批号A01-120101）；蒙脱石散样品分别为浙江海力生制药有限公司（批号140404、140405、140407）、博福-益普生（天津）制药有限公司（批号H07710、H11934、H11940）、先声药业有限公司（批号07-141216）；蒙脱石分散片样品分别为山东绿叶制药有限公司（批号20130605、20140717、20150210）、先声药业有限公司（批号44-150505、44-150701、44-150706）。
2.2 测定法取本品约0.60 g（制剂为取相当于蒙脱石0.60 g的细粉），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加0.020 mol·L-1三氯六氨合钴（Ⅲ）溶液20 mL，摇匀，置37 ℃水浴中，放置1 h，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，按紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版二部附录ⅣA），在474 nm的波长处测定吸光度；另取0.020 mol·L-1三氯六氨合钴（Ⅲ）溶液适量，加水稀释1倍，作为对照溶液，同法测定吸光度，按下式计算吸附力。
吸附力＝
式中：A1为三氯六氨合钴（Ⅲ）对照溶液吸光度；A2为供试品溶液吸光度；C三氯六氨合钴（Ⅲ）溶液浓度，mol·L-1；20即为三氯六氨合钴溶液加入量，mL；M1为供试品量，g；M2为平均装量，g；G为标示量，g。
每1 g蒙脱石应吸附三氯六氨合钴（Ⅲ）[Co（NH3）6]Cl3 0.80~1.30 mmol。
2.3 方法学研究[10-11] 2.3.1 测定方法及反应溶剂的选择三氯六氨合钴（Ⅲ）为黄色或橙黄色结晶，水溶液显橙黄色，最大吸收波长为474 nm。三氯六氨合钴（Ⅲ）与蒙脱石发生反应后溶液颜色消失，因此可采用比色法测定剩余三氯六氨合钴（Ⅲ）的浓度，推算出吸附力。
以硫酸士的宁为标志物测定蒙脱石的吸附力，采用pH 6.8磷酸盐缓冲液作为溶剂，是因为黏土在pH 6.8溶液中吸附力较强，且与小肠pH环境接近。经试验，分别采用pH 6.8磷酸盐缓冲液和水作为溶剂，制备相同浓度的三氯六氨合钴（Ⅲ）溶液，起初三氯六氨合钴（Ⅲ）在2种溶剂中均可完全溶解，但经放置过夜后，pH 6.8磷酸盐缓冲液中会逐渐析出沉淀，最后选择水作为反应溶剂。
2.3.2 实验条件的选择采用正交设计法选择实验条件，综合考虑影响吸附力测定结果的3个因素（反应温度、反应时间及振摇强度），同时考察三氯六氨合钴（Ⅲ）溶液浓度及供试品取样量对实验结果的影响。
经试验，当三氯六氨合钴（Ⅲ）溶液浓度为0.02 mol·L-1，供试品取样量约为0.6 g时，对照溶液及供试品溶液吸光度均在0.5左右，测定结果最为准确。对温度、时间及振摇强度选择结果见表 2、3。
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表 2 正交设计吸附力影响因素试验结果 Table 2 Results of compatibility testing |
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表 3 不同反应时间吸附力测定结果 Table 3 Results of abortion in different reaction time |
经分析，各实验条件的吸附力结果无明显差异，考虑季节及南北方室温的差异，故选择最接近正常人体体温的37 ℃作为实验水浴温度；由于人体胃肠蠕动远远低于水浴振摇速度，因此选择水浴放置，不进行振摇，在确定水浴温度及放置条件后，考虑有文献报道三氯六氨合钴（Ⅲ）与蒙脱石反应6 h后最为稳定，故对反应时间再次进行考察，结果见表 3。
由实验结果判断，除0.5 h的吸附力略低外，其他各时间点的结果基本一致，考虑到蒙脱石进入人体后在胃肠道的滞留时间以及作为止泻药需尽快起效的特点，确定反应时间为1 h。
2.3.3 线性试验精密称取三氯六氨合钴（Ⅲ）约2.7 g（2.675 g），置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得储备液；分别精密量取储备液适量，加水稀释，依次制成浓度分别为3、5、8、10、12、15、20及25 mmol·L-1的系列溶液，测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到线性回归方程：
Y=0.002 8X+0.012 7 r=0.999 9
试验结果表明三氯六氨合钴（Ⅲ）浓度在3~25 mmol·L-1范围内与吸光度呈良好线性关系。
2.3.4 精密度试验分别取原料样品和散剂样品各6份，按上述方法测定样品的吸附力；试验仪器：METTLER XSE205天平、普析T9分光光度计；结果显示日内精密度均良好。另取原料样品和制剂样品6份，采用与日内精密度试验的方法，在不同日、不同的实验室测定；试验仪器：METTLER AE240天平、Thermo EVOLUTION 300 U-VIS分光光度计；结果显示日间精密度良好。本法试验结果可重现，结果见表 4。
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表 4 吸附力精密度试验结果 Table 4 Result of precision testing |
取对照溶液和原料及散剂的供试品溶液，分别在0、3、6、17和24 h分别测定吸光度，计算各溶液吸光度的RSD分别为0.15%、0.17%和0.27%，结果表明对照溶液及供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.6 吸附力换算因子的验证在“1.2”中已理论上推导出三氯六氨合钴（Ⅲ）与硫酸士的宁测定的换算系数为0.43。现分别以2种标志物测定原料及制剂共39批样品的吸附力，计算换算系数，进行试验验证。结果表明39批样品的换算系数平约值为0.43（RSD为1.6%）（表 5），与理论结果相符。
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表 5 吸附力换算因子的验证结果 Table 5 Adsorption coefficient |
为考察国内外不同厂家及纯度的三氯六氨合钴（Ⅲ）对吸附力测定结果的影响，取2家不同企业的原料及制散剂，分别用4家企业的试剂（详见表 2）进行试验，并将标注纯度带入公式计算吸附力，结果见表 6，试验表明试剂纯度对吸附力测定结果的影响在误差范围内，可忽略不计，无需采用高纯度试剂。
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表 6 试剂对吸附力试验结果的影响 Table 6 Effect of experimental reagents |
取蒙脱石适量与过量的三氯六氨合钴（Ⅲ）溶液于37 ℃水浴中反应1 h，滤过，取剩余物用水充分洗涤至滤液无色，室温放置至彻底干燥，精密称取约0.6 g，测定反应后蒙脱石的吸附力，结果为0.038 mmol·g-1，远远低于正常值，说明蒙脱石与三氯六氨合钴（Ⅲ）反应后失去交换能力，且反应为不可逆。
3 讨论 3.1 研究目的多年来蒙脱石吸附力检查需使用硫酸士的宁作为标志物，但硫酸士的宁属于A级有机剧毒物质，长期以来存在的“硫酸士的宁”环境污染、价格昂贵、采购困难等问题始终困扰着蒙脱石生产企业和相关检验结构。本次研究通过对蒙脱石吸附力测定方法进行深入的理论研究，最终选择三氯六氨合钴（Ⅲ）替代硫酸士的宁作为蒙脱石吸附力检查的标志物，并通过方法学研究实验，建立了相应的检验技术标准。三氯六氨合钴（Ⅲ）为合成含钴（Ⅲ）化合物的常用原料，不属于毒性物质，易被蒙脱石吸附，反应迅速且为不可逆，实现了对蒙脱石吸附力的有效控制，试验过程简便、无污染，实现了蒙脱石吸附力的绿色检验。
3.2 方法验证结果经试验验证，采用硫酸士的宁与三氯六氨合钴（Ⅲ）2种物质测定吸附力的结果一致，三氯六氨合钴（Ⅲ）可替代硫酸士的宁作为蒙脱石吸附力测定的标志物。
3.3 吸附力单位本方法吸附力测定结果的单位采用mmol·g-1，这是因为蒙脱石主要通过阳离子交换而发生吸附作用，吸附力的测定亦是通过标志物中的阳离子与蒙脱石分子中等当量的阳离子交换，表示吸附离子的能力，采用摩尔数更为合理；另外，采用mmol的单位可排除标志物的纯度对实验结果造成的误差。
3.4 吸附力限度换算蒙脱石现行标准吸附力测定限度为：每1 g蒙脱石应吸附硫酸士的宁[（C21H22N2O2）2·H2SO4·5H2O] 0.35~0.55 g，经折算硫酸士的宁的摩尔质量432.419 g·mol-1后吸附力约为每1 g 0.0008~0.0013 mol，因此规定吸附力限度为：每1 g蒙脱石应吸附三氯六氨合钴（Ⅲ）[Co（NH3）6]Cl3 0.80~1.30 mmol。
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