2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
2. 贵州省食品药品检验所, 贵阳 550004;
3. 贵州医科大学, 贵阳 550004;
4. 遵义医学院, 遵义 563000
2. Guizhou Institute for Food and Drug Control, Guiyang 550004, China;
3. Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China;
4. Guizhou Zunyi Medical College, Zunyi 563000, China
小叶黄杨Buxus sinica（Rehd. Et Wils）Cheng来源于黄杨科黄杨属植物，最早记载于《本草纲目》，具祛风除湿、活血通络、行气止痛的功效。小叶黄杨中含有的非生物碱类成分较多[1-2]，目前，紫丁香苷和香草酸已从小叶黄杨中分离得到[3-4]。药理研究表明紫丁香苷具有抗炎、抗肿瘤作用[5-6]，姜月红等[7]报道其对大鼠肝缺血再灌注损伤也有保护作用，临床上可用于心肌缺血和免疫力低下等治疗[8]；香草酸具有促凝血作用，对自身免疫性肾炎有保护作用[9-10]。
中药材的成分复杂，其功效是靠多组分共同发挥作用，单一的成分难以代表药材的质量[11-12]，当前，小叶黄杨的质量控制主要集中在环维黄杨星D上[13-14]，紫丁香苷和香草酸的薄层鉴别及含量测定未见报道。《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003年版中小叶黄杨的药用部位为枝叶，而有关文献用的是茎枝[15]，为了更好地控制小叶黄杨的质量，本试验采用TLC法鉴别了小叶黄杨，并用HPLC法测定不同部位中紫丁香苷和香草酸的含量并进行含量比较。结果表明，该方法准确可靠，为合理开发利用小叶黄杨资源提供了科学依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器UltiMate 3000高效液相色谱仪（ThermoFisher）；Xbridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Waters公司）；XS 205电子天平（METTLER TOLEDO公司）；TG 18M台式高速离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；TAISITE电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司有限公司）；DLSB-5120低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；SIMSV0000型纯水机（Millipore公司）；0.45 μm微孔滤膜。
1.2 试药对照品紫丁香苷（含量100%，批号111574-200603）、香草酸（含量100%，批号110776-200402）均购自中国食品药品检定研究院；小叶黄杨药材共11批，采集地上部分，经贵州省食品药品检验所中药标本馆李杨馆长鉴定为黄杨科植物小叶黄杨Buxus sinica （Rehd. et Wils）Cheng，自然晒干后保存于中药标本馆内。薄层硅胶GF254（100 mm×200 mm，青岛海洋化工厂）。甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果 2.1 薄层鉴别取小叶黄杨粗粉（地上部分）约3 g，加稀乙醇40 mL，超声（频率20 kHz，功率200 W）处理1 h，滤过，滤液挥干至约2 mL作为供试品溶液；取紫丁香苷和香草酸的对照品适量，加甲醇使溶解，分别配制成1 mg·mL-1的对照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿-甲醇-甲酸（8:1.2:0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254 nm）下检视。样品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。结果见图 1。
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1~11.小叶黄杨样品（Buxus sinica samples）S.紫丁香苷和香草酸混合对照品（mixture reference substances of syringin and vanillic acid）S1.紫丁香苷对照品（reference substance of syringin）S2.香草酸对照品（reference substance of vanillic acid） 图 1 小叶黄杨薄层色谱图 Figure 1 TLC of Buxus sinica |
采集小叶黄杨地上部分，自然晒干后，将其分为粗茎、细枝、叶和地上部分，分别取各部分约200 g，粉碎使全部通过2号筛，即得不同部位样品。
2.2.2 供试品溶液制备取小叶黄杨地上部分、叶子、细枝和粗茎样品，各2.0 g，精密称定，置250 mL锥形瓶中，加70%甲醇50 mL，回流提取3 h，提取液滤过，滤液水浴蒸干，残渣加50%甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，摇匀，转移至50 mL离心管中，10 000 r·min-1离心2 min，取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.2.3 对照品溶液制备精密称取香草酸0.011 00 g，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得香草酸对照品储备液。精密称取紫丁香苷0.016 80 g，置50 mL量瓶中，加10 mL甲醇溶解后，精密量取香草酸对照品储备液2.5 mL，加50%甲醇溶液稀释至刻度，即得混合对照品储备液（紫丁香苷的浓度为0.336 0 mg·mL-1，香草酸的浓度为0.055 00 mg·mL-1）；精密量取混合对照品储备液3 mL，置10 mL量瓶中，用50%甲醇溶液稀释至刻度，即得混合对照品溶液（紫丁香苷的质量浓度为0.100 8 mg·mL-1，香草酸的质量浓度为0.016 5 mg·mL-1）。
2.2.4 色谱条件采用Xbridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.2%磷酸（17:83），流速1.0 mL·min-1，检测波长264 nm，柱温35 ℃，进样量20 μL。在上述色谱条件下，各组分分离度良好，见图 2。
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1.紫丁香苷（syringin）2.香草酸（vanillic acid）A.对照品（reference substances）B.小叶黄杨粗茎（the main stem of Buxus sinica）C.小叶黄杨细枝（the twigs of Buxus sinica）D.小叶黄杨叶（the leaves of Buxus sinica）E.小叶黄杨地上部分（the aerial part of Buxus sinica） 图 2 紫丁香苷和香草酸对照及小叶黄杨样品不同部位的HPLC图 Figure 2 HPLC chromatograms of reference substances of syringin and vanillic acid and the Buxus sinica samples from different parts |
精密量取上述“2.2.3”项下的混合对照品储备液0.1、1、3、5、7、9 mL，分别置10 mL量瓶中，用50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得系列对照品溶液；精密吸取上述系列对照品溶液各20 μL，分别按“2.2.4”项下的色谱条件，进样测定峰面积。以对照品质量浓度X（mg·mL-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，得紫丁香苷、香草酸的回归方程：
Y=752.1X+0.320 0 r=0.999 5
Y=1 255X+0.025 00 r=0.999 5
结果表明紫丁香苷和香草酸分别在3.36~302.4和0.55~695.5 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.2.6 精密度试验精密量取“2.2.3”项下的混合对照品溶液20 μL，按“2.2.4”项下条件连续进样6次，计算紫丁香苷、香草酸峰面积的RSD分别为0.16%和0.15%，表明仪器精密度良好。
2.2.7 稳定性试验取小叶黄杨（4号）地上部分粉末2 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0、2、4、8、12、24 h按“2.2.4”项下条件进样测定，计算紫丁香苷、香草酸峰面积的RSD分别为1.2%和0.36%，说明24 h内供试品溶液稳定性良好。
2.2.8 检测限和定量限试验精密量取混合对照品溶液适量，做系列稀释后进行测定，以各峰达信噪比3倍和10倍时的量分别为检测限和定量限。结果紫丁香苷的检测限为0.067 2 μg·mL-1，定量限为0.168 μg·mL-1；香草酸的检测限为0.027 5 μg·mL-1，定量限为0.091 μg·mL-1。
2.2.9 重复性试验取小叶黄杨（4号）地上部分粉末2 g，共6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.4”项下条件进样测定，计算紫丁香苷、香草酸平均含量分别为0.310和0.053 mg·g-1，RSD均为1.6%，表明该方法重复性良好。
2.2.10 加样回收率试验取已知含量的小叶黄杨（4号）地上部分粉末（紫丁香苷含量为0.310 mg·g-1，香草酸含量0.053 mg·g-1）1 g，共9份，精密称定，分成3组，每组分别加入混合对照品储备液（紫丁香苷的浓度为0.336 0 mg·mL-1，香草酸的浓度为0.055 00 mg·mL-1）0.5、1.0、1.5 mL，混匀，按“2.2.2”项下的方法制备成供试溶液，按“2.2.4”项下条件进样测定，计算紫丁香苷、香草酸3种浓度水品平均加样回收率（n=9）分别在99.8%~103.0%和98.4%~101.1%范围内，表明该方法准确性良好。结果见表 1。
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表 1 小叶黄杨中紫丁香苷和香草酸的加样回收率试验 Table 1 Result of sample recovery rate |
分别称取小叶黄杨不同药用部位样品2.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.4”项下条件测定，采用外标一点法计算紫丁香苷和香草酸的含量，结果见表 2。
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表 2 小叶黄杨不同部位紫丁香苷和香草酸含量测定结果（n=2） Table 2 The determination results of syringin and vanillic acid in different portions of Buxus sinica |
分别考察了三氯甲烷-甲醇-无水甲酸、三氯甲烷-甲醇-甲酸、三氯甲烷-甲醇-水（10 ℃放置的下层溶液）和正己烷-氯仿-冰乙酸等展开体系，结果表明三氯甲烷-甲醇-甲酸（8:1.2:0.5）作为展开剂，斑点清晰，分离度好。
3.2 HPLC流动相的选择考察了不同甲醇-酸水系统（0.05%三氟乙酸、0.4%甲酸、0.4%磷酸、0.2%磷酸水溶液和纯水），结果表明0.2%磷酸溶液作为水相时，分离度较好，故流动相确定为甲醇-0.2%磷酸水溶液。
3.3 检测波长的选择采用二极管阵列检测器，在200~400 nm波长下对供试品溶液和对照品溶液进行全波长扫描，紫丁香苷在264 nm和220 nm下有最大吸收，香草酸分别在261、217和204 nm下有最大吸收，考虑靠近末端吸收的204、217和220 nm作为检测波长时，溶剂峰大，基线漂移，而用264 nm时，溶剂峰小，基线平稳，紫丁香苷和香草酸响应值均较大，故最终采用264 nm作为HPLC法的检测波长。
3.4 供试品溶液的制备在HPLC法测定含量的试验过程中，考察了提取溶剂（甲醇、乙醇、正丁醇）、不同浓度的甲醇（80%、70%、50%）、提取方法（超声和加热回流）和提取时间（1、2、3和5 h）对样品溶出结果的影响，结果表明70%甲醇溶液加热回流提取3 h效果好。曾用甲醇、70%甲醇溶液溶解并定容样品，紫丁香苷和香草酸均有分叉峰，当用50%甲醇溶解稀释样品时，紫丁香苷和香草酸峰形对称，无分叉峰，故用50%甲醇溶液溶解并定容样品。
3.5 不同部位含量测定小叶黄杨叶、细枝和粗茎中均能提取紫丁香苷和香草酸，紫丁香苷在粗茎、细枝、叶和地上部分中的含量分别为0.030~0.324、0.002~0.518、0.013~0.907和0.010~0.667 mg·g-1，香草酸在粗茎、细枝、叶和地上部分中的含量分别为0.025~0.077、0.021~0.087、0.012~0.132和0.020~0.123 mg·g-1。使用SPSS 16.0软件中随机区组设计资料的方差分析方法进行分析，单侧P紫丁香苷=0.000 < 0.05、P香草酸=0.008 < 0.05，所选模型有统计学意义。不同部位紫丁香苷的多重比较中，粗茎与细枝比较P=0.030，粗茎与叶比较P=0.000，叶和细枝比较P=0.001，按a=0.05水准认为粗茎、细枝和叶含量有差异，且紫丁香苷含量最高的是叶子，粗茎中最低，叶子比细枝中的含量高1.5~6.6倍，比粗茎高2.4~59倍。不同部位香草酸的多重比较中，粗茎与细枝比较P=0.212，粗茎与叶比较P=0.841，叶和细枝比较P=0.151，按a=0.05水准认为粗茎、细枝和叶含量无差异。
3.6 结论小叶黄杨不同部位均含有紫丁香苷和香草酸，且紫丁香苷含量差异较大，叶含量＞细枝含量＞粗茎含量，而香草酸在叶、细枝和粗茎中的含量无差别，但为了采药方便，可持续利用和保护药材资源，建议选取药材时，以叶子为药用部位为好，该结果为开发利用小叶黄杨资源以及临床应用提供了科学依据。
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