2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
2. 河南中医学院, 郑州 450046
2. Henan College of TCM, Zhengzhou 450046, China
杞菊地黄口服液由枸杞子、菊花、熟地黄、酒萸肉、山药、盐泽泻、牡丹皮和茯苓8味药材组成，临床应用广泛。《中药部颁成方制剂》第11册以芍药苷的含量限定来控制杞菊地黄口服液的质量，不能很好控制制剂质量[1]。《中国药典》2015年版采用HPLC法同时测定杞菊地黄丸（浓缩丸）中的莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的含量，作为方中山茱萸和牡丹皮的质量控制方法[2]，该法对杞菊地黄口服液的质量控制有很好的借鉴意义。山茱萸新苷为山茱萸中除莫诺苷和马钱苷外又一有效成分，具有抗炎，保护大鼠皮层细胞及保肝护肝等药理作用[3]，亦可作为质量控制指标性成分。本研究通过同时测定莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和丹皮酚的含量来控制杞菊地黄口服液的质量，并防止非法添加。但由于各对照品价格昂贵，市场供应量有限等，使质量控制成本大大增加。
一测多评法（QAMS法）是多指标质量控制的模式之一，既能够实现多指标性成分的同时测定，又可以解决部分对照品难以获得或价格昂贵的问题，可显著节约检验检测成本[4]，该法已经成功应用于双青咽喉片[5]、三黄片[6]、胃苏颗粒[7]等多种中成药的质量控制中。本研究在参考文献[8-12]的基础上，采用一测多评的方法，以较为廉价易得的马钱苷为内参物，建立其与莫诺苷、山茱萸新苷和丹皮酚之间的相对校正因子，同步测定4个有效成分的含量，可以在节约多成分含量测定检验成本的同时，较全面地控制杞菊地黄口服液的质量。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent ChemStation工作站；岛津LC-20A高效液相色谱仪，Lab solution工作站；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Thermo ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Phenomenex Luna C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。Precisa XR 205SM-DR分析天平；昆山市超声仪器有限公司KQ-250型超声波清洗器。
1.2 试药对照品马钱苷（批号111640-201005，纯度99.2%）和丹皮酚（批号110708-200506，纯度100%）均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用；对照品莫诺苷（批号140301，纯度≥98%）和山茱萸新苷（批号131015，纯度≥98%）均购自成都普菲德生物技术有限公司。乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。杞菊地黄口服液（江西济民可信药业有限公司，批号150101、140302，每支装10 mL，无糖型；河南同源制药有限公司130801、131101，每支装10 mL）。
2 方法与结果 2.1 溶液制备 2.1.1 对照品溶液分别取莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和丹皮酚的对照品适量，加甲醇配制成质量浓度分别为莫诺苷2.356 5 mg·mL-1、马钱苷1.313 4 mg·mL-1、山茱萸新苷0.314 8 mg·mL-1和丹皮酚2.566 5 mg·mL-1的单一对照品溶液；取莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1 mL含莫诺苷32.39 μg，马钱苷33.90 μg，山茱萸新苷7.75 μg和丹皮酚76.88 μg的混合对照品溶液。将上述混合对照品溶液于4 ℃保存，备用。
2.1.2 供试品溶液精密量取本品10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度摇匀，滤过，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.1.3 阴性对照溶液按杞菊地黄口服液处方比例和制备方法，分别制备缺酒萸肉、缺牡丹皮和缺酒萸肉和牡丹皮2种饮片的阴性样品，按“2.1.2”项下方法操作，制备缺酒萸肉、缺牡丹皮和双缺阴性对照溶液。
2.2 液相色谱条件采用Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent ChemStation工作站。色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序见表 1。流速：1 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：240 nm（0~79 min，测定莫诺苷，马钱苷和山茱萸新苷）、274 nm（80~95 min，测定丹皮酚）；进样量：10 μL。
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表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution procedures |
分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按上述色谱条件进样测定，结果见图 1。由图 1可知，各待测色谱峰均达到基线分离，阴性对照色谱中，在与莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和丹皮酚相对应的保留时间处无干扰。
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1.莫诺苷（morroniside）2.马钱苷（loganin）3.山茱萸新苷（cornuside）4.丹皮酚（paeonol） 图 1 混合对照品（A）、样品（B）、牡丹皮阴性（C）、酒萸肉阴性（D）、牡丹皮和酒萸肉阴性（E）HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A), samples(B), negative samples without Paeonia suffruticosa Andr.(C), wine processed Fructus Corni(D), and Paeonia suffruticosa Andr. and wine processed Fructus Corni(E) |
取莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和丹皮酚的对照品适量，加入甲醇配制成质量浓度为莫诺苷180.42 μg·mL-1，马钱苷171.26 μg·mL-1，山茱萸新苷76.30 μg·mL-1，丹皮酚209.04 μg·mL-1的混合对照品溶液。精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、8、10、12、15、20 μL，分别注入高效液相色谱仪，以对照品的进样量X（μg）为横坐标，对照品色谱峰面积Y为纵坐标，绘制曲线，计算回归方程。取混合对照品溶液逐级稀释，分别以信噪比3和10考察各成分的检测限和定量限，各成分回归方程、线性范围及检测限和定量限结果见表 2。表明各成分进样量在各自范围内与峰面积呈良好的线性关系。
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表 2 4种成分线性范围、回归方程和相关系数 Table 2 Linearity range, regression equation and correlation coefficient of 4 compounds |
精密吸取同一供试品溶液（样品批号130801）10 μL，连续进样6次，记录莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和丹皮酚的峰面积积分值，计算RSD；结果各成分峰面积的RSD分别为0.71%、0.48%、1.64%和0.98%，表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液（样品批号130801）10 μL，分别于配制后的0、2、4、8、10、15和24 h进样测定峰面积积分值，计算RSD；结果莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为1.22%、2.13%、1.45%和0.85%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.4 重复性试验取同一批样品（批号130801），按“2.1.2”项下方法，平行制备6份供试品溶液，进样测定峰面积并计算含量；结果莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和丹皮酚平均含量分别为0.451、0.225、0.058和0.556 mg·mL-1，RSD分别为2.45%、1.37%、2.74%和1.63%，表明该方法的重复性良好。
2.3.5 加样回收率试验取已测知含量的样品（批号130801）5 mL（相当于莫诺苷2.255 mg，马钱苷1.125 mg，山茱萸新苷0.290 mg，丹皮酚2.780 mg）共6份，分别加入对照品溶液（莫诺苷2.356 5 mg·mL-1、马钱苷1.313 4 mg·mL-1、山茱萸新苷0.314 8 mg·mL-1和丹皮酚2.566 5 mg·mL-1）各1 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定峰面积，计算莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和丹皮酚的平均加样回收率（n=6）分别为96.91%、96.94%、97.26%和97.24%，RSD分别为1.47%、1.95%、0.76%和1.74%。
3 相对校正因子和相对保留时间的测定 3.1 待测组分相对校正因子计算精密吸取混合对照品溶液1、2、5、8、10、12、15 μL进样分析。以马钱苷（A）为内参物，根据相对校正因子计算公式[13]：
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表 3 相对校正因子 Table 3 The relative correction factors |
分别考察Agilent 1260、岛津LC-20A高效液相色谱仪和Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表 4。结果表明，不同高效液相色谱仪及色谱柱对相对校正因子无显著影响。
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表 4 不同高效液相色谱仪及色谱柱的相对校正因子 Table 4 Relative correction factors in different high performance liquid chromatographs and columns |
本研究分别考察相对保留值和保留时间差在不同品牌仪器和不同规格色谱柱中的重现性。结果表明保留时间差的波动较为明显，RSD＞5%，相对保留时间的波动相对较小，因此采用相对保留时间定位待测组分色谱峰，结果见表 5、6，莫诺苷、山茱萸新苷和丹皮酚的相对保留时间分别为0.564、1.360和1.578。
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表 5 不同仪器和色谱柱相对保留值比较 Table 5 Relative retention time determined by different instruments and columns |
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表 6 不同仪器和色谱柱保留时间差比较 Table 6 Retention time difference determined by different instruments and columns |
各样品按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取4批供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪进行测定。采用外标法（ESM法）和一测多评法（QAMS法）计算杞菊地黄口服液中莫诺苷，马钱苷、山茱萸新苷和丹皮酚的含量，结果见表 7。表明2种含量测定方法无显著性差异，相对误差＜5%。
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表 7 QAMS法与ESM法测得的杞菊地黄口服液中4种成分含有量（mg·mL-1，n=2） Table 7 Contents determination of Qijudihuang oral liquid by QAMS and ESM |
由于马钱苷为中国药典2015年版规定的山茱萸质量控制指标性成分，性质稳定，市场流通性强，较易得到，且其出峰时间和峰面积适中。而莫诺苷和山茱萸新苷价格较昂贵，丹皮酚与其余3种成分相比，峰面积较大，出峰时间较迟，因此选择马钱苷为内参物。根据目标峰与内参峰之间的相对保留值即能够正确判断出各目标峰的准确位置。
5.2 流动相及柱温的考察比较了甲醇和乙腈作为有机相，不同浓度的磷酸水溶液作为无机相的梯度洗脱效果，结果发现乙腈-0.3%磷酸水溶液洗脱分离效果较好，达到基线分离，所以选择乙腈-0.3%磷酸水梯度洗脱系统为流动相。比较了25、30、35和40 ℃，4种不同的色谱柱温对分离效果的影响，结果当柱温为35 ℃时，各成分分离效果和峰形良好。
5.3 小结采用一测多评法所得杞菊地黄口服液中4种有效成分含量与常规的外标法所测得的含量间无显著差异，说明在无对照品的情况下，通过一测多评法实现杞菊地黄口服液含量测定准确可行。
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