2017, Vol. 37 
2. 沈阳药科大学中药学院, 沈阳 110016;
3. 北京中医药大学中药学院, 北京 100102;
4. 中国药科大学, 南京 211198
2. School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China;
3. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China;
4. China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China
猪胆是一种重要的动物来源的中药材，中国自古就将其作为药用，首载于《名医别录》，距今已有千余年药用历史。《本草纲目》中描述猪胆为“苦、寒、无毒”，用于治疗“赤白痢、小便不通、消渴无度、目翳、目赤肿痛、疔疮恶肿、风闭塞”等病症，称“方家用猪胆，取其寒能胜热，滑能润燥，苦能入心，又能去肝胆之火也”。猪胆的传统制法是将猪宰杀后，剖腹将胆囊取出，胆汁鲜用或将胆囊挂起晾干。现代常将猪的胆汁滤过，干燥，粉碎制得猪胆粉，具有清热润燥、止咳平喘、解毒的功效，主要用于顿咳、哮喘、热病燥渴、目赤、喉痹、黄疸、泄泻、痢疾、便秘、痈疮肿毒的治疗[1-2]。
猪胆粉中主要含有胆汁酸、胆色素、蛋白和脂等类成分。其中胆汁酸类成分是其主要成分，主要有猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸（taurohyodeoxycholic acid，THDCA）、牛磺鹅去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸（glycohyodeoxycholic acid，GHDCA）和甘氨鹅去氧胆酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDCA）[2-6]。胆汁酸类成分不仅是猪胆粉中的主要成分，也是其主要的活性成分，因此常通过对该类成分的定性和定量分析来达到对猪胆粉药材的质量评价与控制的目的。中国药典2015年版一部[1]仅对其中的THDCA进行了含量控制，然而从本文研究发现，猪胆粉中的甘氨结合型胆汁酸含量最高，而GHDCA和GCDCA是其含量最高的2个胆汁酸类成分，这2种胆汁酸含量之和约为40%以上。
胆汁酸类成分的测定方法主要有薄层扫描法（TLCS法）[7]、高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV法）[8]、高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD法）[9-11]、气相色谱法（GC法）[12]、氢核磁共振法（1H NMR法）[13-14]、胶束电动毛细管电泳法（MEKCE法）[15]、高速逆流层析与蒸发光散射联用法（HSCCC-ELSD法）[16]、气相色谱-质谱法（GC-MS法）[17-18]、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS法）[19-21]、液相色谱-质谱法（LC-MS法）[22-25]以及柱前衍生化HPLC法[26-29]。由于胆汁酸类成分缺少共轭结构，因此紫外吸收极弱，不经衍生化的情况下，HPLC-UV法只能使用末端吸收，才能对其进行检测，灵敏度与准确度均不理想。目前，胆汁酸类成分的测定手段多为HPLC-ELSD法及LC-MS法。HPLC-ELSD法的检测成本较低，测定的灵敏度不高，而LC-MS法测定灵敏度较好，更适合测定样品中的微量成分，其仪器的维护和测定成本很高。由于本文主旨是对猪胆粉中的主要胆汁酸类成分进行测定研究，所以选用了较低成本的HPLC-ELSD法，其较低的成本以及较易维护的特点也更利于方法的推广使用。
全轮廓色谱数据研究是以连续的色谱数据点为研究变量，相较于以已积分的色谱峰或已测定的成分含量为研究对象的方式而言，具有更加全面、客观等优点，不仅可有效避免微小色谱信息的遗漏，也可避免积分误差引起的错误结论，而且对色谱峰的完全分离要求不高。本文在完成22批不同来源的猪胆粉样品中主要胆汁酸类成分的测定研究之外，还尝试运用系统聚类分析和主成分分析这2个最常用的化学计量学方法对所测样品的HPLC-ELSD全轮廓图谱进行分析研究，藉此为猪胆粉药材的质量评价与控制提供技术参考。
1 仪器与试药 1.1 仪器Waters 2695高效液相色谱仪（Waters，美国）；Alltech 2000ES蒸发光散射检测器（Alltech，美国）。Agilent SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基键合硅胶；Agilent，美国）。数据处理使用Empower 3网络版液相色谱工作站（Waters，美国）和Matlab 2009a数学软件（Mathworks，美国）。Mettler AE240电子天平（Mettler-Toledo，瑞士）；KQ-300DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，中国）。
1.2 试药乙腈为色谱级，水为Milli-Q超纯水，甲酸为质谱级，其他试剂均为分析纯。
GHDCA（批号24-CF-57-3）来自加拿大TRC公司，甘氨鹅去氧胆酸钠（GCDCA-Na，批号081M5209V）来自美国SIGMA公司；两者纯度均大于98%。
测定样品为22批猪胆粉样品，其中序号为1~16的样品（编号ZD1~ZD16）为自制样品（将鲜猪胆汁过滤，冷冻干燥后制得），序号为17的样品（编号ZD-STD）为猪胆粉对照药材（批号121273-201101，中国食品药品检定研究院），序号为18~22的样品（编号ZD-S-1~ZD-S-5）为市售样品。
2 主要胆汁酸类成分的测定 2.1 供试品溶液的制备取样品粉末约25 mg，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，称量，超声（功率300 W，频率40 kHz）处理20 min，甲醇补足减失的量，过滤，即得。
2.2 对照品溶液的制备精密称取GHDCA对照品适量，加甲醇配成每1 mL含GHDCA为0.810 mg的对照品母液，以及每1 mL含GHDCA分别为0.091、0.162、0.230、0.253、0.276 mg的系列对照品溶液。
取GCDCA-Na对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含GCDCA-Na为0.400 mg的对照品母液以及每1 mL含GCDCA-Na分别为0.040、0.080、0.120、0.160、0.200 mg的系列对照品溶液。
2.3 色谱条件采用Agilent SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温40 ℃，流动相为0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~20 min，25%B→55%B；20~21 min，55%B→25%B），流速1.0 mL·min-1；ELSD漂移管温度110 ℃，氮气流量2.8 L·h-1，增益为1；进样量10 μL。
在上述色谱条件下，对照品溶液和供试品溶液色谱图见图 1。
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图 1 对照品及样品的色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances and samples |
精密吸取系列对照品溶液各10 μL进样，测定并记录各对照品溶液色谱图中色谱峰峰面积，以对照品进样量（μg）的对数值为横坐标，对应的色谱峰峰面积的对数值为纵坐标，绘制GHDCA和GCDCA-Na的标准曲线。GHDCA和GCDCA-Na质量浓度分别在0.091~0.276 mg·mL-1和0.040~0.200 mg·mL-1范围内线性关系良好，回归方程及相关系数分别为
Y=1.440 5X+6.036 8 r2=0.999 2
Y=1.596 3X+5.982 3 r2=0.999 9
2.4.2 精密度试验取ZD2样品的供试品溶液连续进样6次，记录待测成分色谱峰峰面积，计算GHDCA和GCDCA-Na峰面积的RSD分别为0.4%和1.1%。
2.4.3 重复性试验取ZD2样品，平行制备供试品溶液6份，分别进样，测定ZD2猪胆粉样品中GHDCA和GCDCA（由GCDCA-Na换算可得）的平均含量分别为32.2%和18.4%，RSD分别为1.3%和1.6%。
2.4.4 回收率试验取ZD2样品6份，每份约12.5 mg，分别精密称定并精密加入质量浓度为0.810 mg·mL-1的GHDCA对照品溶液和质量浓度为0.400 mg·mL-1的GCDCA-Na对照品溶液各5 mL，再分别精密加入甲醇40 mL，称量，超声（功率300 W，频率40 kHz）处理20 min，甲醇补足减失的量，过滤，进样，测定得GHDCA和GCDCA-Na的平均回收率（n=6）分别为100.6%和99.0%，RSD分别为1.9%和2.3%。
2.4.5 稳定性试验取ZD2样品的供试品溶液，分别在0、4、12、24、36、48、60 h进样，分别测定GHDCA和GCDCA的峰面积，计算两者峰面积的RSD分别为2.3%和3.0%，结果表明供试品溶液60 h内稳定性良好。
2.4.6 检测下限与定量下限的确定将GHDCA和GCDCA-Na对照品溶液分别稀释至适合的浓度，信噪比为3:1时的进样量（ng）为检测下限（LOD），信噪比为10:1时的进样量（ng）为定量下限（LOQ）。结果GHDCA的LOD与LOQ分别为15.2 ng和50.7 ng，测定GCDCA-Na的LOD与LOQ分别为15.0 ng和50.0 ng。
2.5 样品测定结果将16批自制猪胆粉样品、5批市售猪胆粉样品和1批猪胆粉对照药材按照“2.1”项方法制备成供试品溶液，并按照上述色谱条件进行测定，以标准曲线法计算GHDCA和GCDCA（由GCDCA-Na换算可得）含量，结果见表 1。
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表 1 猪胆粉样品测定结果 Table 1 The contents of the two major BAs in the samples of pig bile powder |
由于色谱采集的外部环境变化以及仪器的波动等因素，各批次样品的色谱图中相同成分的色谱峰的保留时间会有一定的漂移，因此在全轮廓色谱图的分析之前，必须要对谱图进行保留时间的校正。
本文中猪胆粉的色谱图有3 600个横坐标数据点，因此22批猪胆粉色谱数据可组成22×3 600的二维矩阵。本文采用COW算法对各批猪胆粉的HPLC-ELSD谱图信号进行保留时间的校正；相关参数：segment length=35，slack size=5；校正前后见图 2。
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图 2 各批样品色谱图校正前（A）和校正后（B）色谱图 Figure 2 Unaligned(A)and aligned(B)chromatograms of all batches of samples |
由图 2可知，未经保留时间校正的各共有色谱峰的出峰时间均有一定程度的波动，而经过校正后，各共有色谱峰的出峰时间均能达到较好的一致性，较好地排除了随机误差及部分系统误差的影响，适合进行下一步的数据分析。
3.2 系统聚类分析对校正后的各批样品色谱数据进行分析，即为对该二维矩阵进行分析。不同于色谱峰面积和成分含量，全轮廓谱图常会出现随机信号噪音等可能干扰数据分析的情况，因此为得到最佳的数学分析模型，通常需要在对数据进行分析前对谱图数据进行适当预处理。本文采用标准正态变量法（standard normal variate，SNV）对矩阵数据进行处理，然后对处理得到的数据取一阶导数，最后对经过预处理的矩阵数据进行系统聚类分析（ward法），见图 3。
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图 3 系统聚类分析树状图 Figure 3 The dendrogram of hierarchical clustering analysis |
由图 3可以看出，16批自制猪胆粉样品、1批猪胆粉对照药材样品和1批市售猪胆粉样品（ZD-S-1）可聚为一类，而其余各批市售猪胆粉样品均不能聚成一类，并且分别与上述聚类距离远近不同，相距最远的样品为ZD-S-3，其次为ZD-S-5。系统聚类分析的结果与各批样品所含主要胆汁类成分的结果具有高度的一致性。
3.3 主成分分析与系统聚类分析相同，在对矩阵数据进行主成分分析前，首先采用标准正态变量法和一阶导数法对数据进行预处理。本文所建立的主成分分析模型的前3个主成分方差贡献率分别为53.81%、24.19%和3.80%，可见第一和第二主成分的方差最大，累计方差贡献率已达78.00%，基本达到表征该数学模型的要求，各批样品的第一和第二主成分的二维得分图见图 4。
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图 4 样品主成分分析二维得分图 Figure 4 The 2D score scatter plot of PCA |
由图 4可看出2批市售样品ZD-S-3和ZD-S-5距离其他样品均较远，其中ZD-S-3与其他样品的距离主要体现在第一主成分，而ZD-S-5与其他样品的距离主要体现在第二主成分，由于ZD-S-3和ZD-S-5的存在，拉大了图 4中的横坐标和纵坐标的比例，相对来说其他样品聚为一类。
将第三主成分加入，绘制样品的三维主成分得分图，见图 5。由图 5可知，虽然第三主成分的方差贡献率远不及第一和第二主成分，然而将其加入进行分析，可发现更多的样品隐含信息。虽然样品ZD-S-2和ZD-S-4与大部分样品的第一和第二主成分的得分相近，但是第三主成分的得分却差别较大。在图 3中，样品ZD-S-1可以与自制样品和对照药材样品聚成一类，但是其在第三主成分的得分上仍存在一些差异，而自制样品和对照药材样品则完全聚在一起。
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图 5 样品主成分分析三维得分图 Figure 5 The 3D score scatter plot of PCA |
由表 2可知，2批市售猪胆粉ZD-S-3与ZD-S-5中均未检出GHDCA和GCDCA成分，而其余20批猪胆粉样品均可检出GHDCA和GCDCA，GHDCA含量在6.4%~36.5%之间，GCDCA含量在4.5%~27.0%之间，均具有较高含量。在上述20批样品中有15批样品的GHDCA含量高于GCDCA，占20批样品的75%，而只有25%的样品的GCDCA含量高于GHDCA，可见多数情况下，猪胆粉中GHDCA含量应该高于GCDCA含量。
自制的猪胆粉中，GHDCA和GCDCA的平均含量分别为26.9%和19.9%，而可检出GHDCA和GCDCA的3批市售猪胆粉中GHDCA和GCDCA的平均含量分别为12.8%和10.0%，猪胆粉对照药材与自制猪胆粉样品中的GHDCA和GCDCA含量差距不大，而市售猪胆粉中GHDCA和GCDCA含量则相对较低。
与组分变量相比，全轮廓谱图代表着更大量的样品信息，以其为自变量进行分析所得到的结果显然也更加准确和全面，并且其对色谱峰的完全分离及组分数值（含量或峰面积）测定的准确性要求很低，最大程度减小了测定的准确性对分析结果造成的影响。本文对全轮廓谱图的分析中所使用的COW算法是目前十分常用的信号校正算法，其校正的关键点在于Segment length和Slack size的优化与选择。该法与传统指纹图谱软件的色谱峰校正方法相比，具有无需预先进行色谱峰的积分处理和对色谱峰分离要求不高的优点，并且可对非共有峰的样品进行统一处理，可更多地保留原谱图的信息。本文采用2种无监督的方法对样品进行分析，结果均与含量测定结果的分析一致。
中国药典2015年版[1]明确规定猪胆粉药材的制法为“取猪胆汁，滤过，干燥，粉碎，即得。”本文中自制猪胆粉所用猪胆汁均为从屠宰场购得新鲜猪胆囊，将其小心剪开口后挤出胆汁过滤所得，然后严格按照制法进行干燥并粉碎。在干燥方法选择时，为避免常温下干燥时间过长可能导致的蝇虫污染和腐败变质等情况的发生，采取了冷冻干燥的方式。
通过对样品的分析与测定可以发现，自制的猪胆粉样品与对照药材样品具有高度的一致性，而这两者均与市售猪胆粉药材存在有一定的差异，结合样品的外观性状进行分析，这种情况有可能是加工过程中添加辅料所致。中国药典2015年版一部[1]中对该药材的制法并无可以添加辅料的描述，并且辅料添加的种类等级及其添加的比例也会直接关系到猪胆粉药材的安全性与有效性。5批市售样品中，有2批均未检出GHDCA和GCDCA这2种猪胆粉中的主要胆汁酸类成分，表明这2批样品极有可能为假冒的猪胆粉药材，由以上分析可见，市售猪胆粉药材的质量问题十分值得关注。
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