2017, Vol. 37 
2. 浙江省食品药品检验研究院, 杭州 310052
2. Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou 310052, China
氟胞嘧啶为抗真菌类药物，广泛应用于临床，用于念珠菌属心内膜炎、隐球菌属脑膜炎[1-2]、念珠菌属或隐球菌属真菌败血症、肺部感染和尿路感染，中国药典2015年版二部[3]已收载。其生产工艺中使用了N，N-二甲基苯胺，N，N-二甲基苯胺具有基因毒性，基因毒性杂质对人体的DNA有直接作用，导致DNA的损伤，从而带有致癌、致畸或致突变的性质。哪怕是极少量的基因毒性杂质对人体造成的损害也是极其严重的。因此对基因毒性杂质的研究引起各界的广泛关注[4]。
由于基因毒性杂质极其危险，美国FDA和欧洲药品管理局（EMA）[5-6]规定了毒理学担忧阙值（TTC）：人在长期用药时，潜在毒性杂质每日摄入量不能超过1.5 μg [7]。根据上述规定，可进行如下计算：N，N-二甲基苯胺TTC限度为1.5μg·d-1，而氟胞嘧啶最大日服用剂量为6 g，所以氟胞嘧啶中基因毒性杂质N，N-二甲基苯胺的限度为0.000 025%，因此对基因毒性杂质需采用痕量分析的方法。
文献报道[8]指出，质谱检测是基因毒性杂质定量分析的重要技术。对痕量杂质的分析，微量的损失对测定结果的影响是非常大的，Devenport等[9]创新性地在大气压条件下利用质谱直接定量测定模拟药物中基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯，这种方法时样品测定更加便捷，并可实现对药物的高通量检测。Kakasaheb等[10]利用GC-MS的方法，对坎地沙坦中合成起始原料中的基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯进行定量测定，方法学验证结果符合ICH规定的要求，并且这个方法适用于上市药品中基因毒性杂质的含量测定。有文献报道[11-12]对氟胞嘧啶体液浓度及其有关物质进行测定，采用了HPLC法，但未涉及到其中基因毒性杂质的分析研究。因此必须研究满足限度要求的高灵敏度检测方法，对痕量的基因毒性杂质N，N-二甲基苯胺进行检测与控制，以保证氟胞嘧啶用药的安全性。本文研究建立了液相色谱-质谱联用法测定氟胞嘧啶中痕量基因毒性杂质N，N-二甲基苯胺，进行了方法学验证，并测定了3批样品中N，N-二甲基苯胺的残留，为氟胞嘧啶中N，N-二甲基苯胺的检测提供良好解决方案。
1 仪器与试药Agilent 1290液相色谱仪（安捷伦公司）；Agilent 6490三重四极杆质谱仪（安捷伦公司）；XPE205型电子天平（梅特勒托利多公司）。Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）。
氟胞嘧啶（批号：AB-1410001，AB-1410002，AB-1411001），浙江先锋科技股份有限公司提供；N，N-二甲基苯胺（批号：20110505），浙江先锋科技股份有限公司提供；甲醇、甲酸为色谱纯，水为超纯水。
2 方法与结果 2.1 色谱质谱条件 2.1.1 色谱色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：水（含0.1%甲酸）-甲醇（含0.1%甲酸）（95:5）；流速：0.2 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：1 μL；运行时间：7 min。
2.1.2 质谱采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式MRM采集，参数见表 1；干燥气温度：250 ℃；干燥气流速：11 L·min-1；雾化器压力：275.8 kPa；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：8 L·min-1；毛细管电压：4.0 kV；喷嘴电压：1.5 kV。
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表 1 MRM采集参数设置 Table 1 MRM sampling parameter |
中国药典2015年版氟胞嘧啶分析的液相色谱流动相为水（用磷酸调节pH为3.5）-甲醇（95:5）。为了能适用于液质联用，通过试验，将流动相调整为水（含0.1%甲酸）-甲醇（含0.1%甲酸）（95:5）。
取氟胞嘧啶和N，N-二甲基苯胺对照品各适量，加流动相溶解并稀释制成质量浓度均为2.5 ng·mL-1的混合对照品溶液，在SCAN模式下进样分析，结果如图 1所示，氟胞嘧啶与N，N-二甲基苯胺能够有效分离，为避免高浓度的主成分（氟胞嘧啶）进入质谱造成污染，将0~3 min的流路切入废液，3 min后流路切入质谱。
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1.氟胞嘧啶（flucytosine），2.N，N-二甲基苯胺（N，N-dimethylaniline） 图 1 混合对照品溶液总离子流图 Figure 1 Total ion current of mix reference substances solution |
取N，N-二甲基苯胺对照品适量，加流动相溶解并稀释制成质量浓度为2.5 ng·mL-1的对照品溶液，在SCAN模式下进样，进行一级MS分析，质谱图见图 2，母离子m/z为122.2。
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图 2 N，N-二甲基苯胺对照品溶液一级MS扫描 Figure 2 MS scanning of N, N-dimethylaniline standard solution |
取质量浓度为2.5 ng·mL-1的对照品溶液，在Product Ion模式下进样，进行MS2分析，质谱图见图 3，定量离子选择m/z为106.1的子离子，定性离子选择m/z为77.1的子离子。
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图 3 N，N-二甲基苯胺对照品溶液MS2扫描 Figure 3 MS2scanning of N, N-dimethylaniline reference substance solution |
N，N-二甲基苯胺的质谱图中m/z122.2为[M+H]+离子，质谱显示m/z122.2的[M+H]+离子通过N-C键断裂生成m/z106.1的碎片离子，m/z106.1的碎片离子进一步脱去-NCH3生成m/z77.1的碎片离子。质谱裂解方式如图 4所示。
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图 4 N，N-二甲基苯胺的质谱裂解途径 Figure 4 MS fragmentation pathway of N, N-dimethylaniline |
取质量浓度为2.5 ng·mL-1的对照品溶液，在Product Ion模式下进样分析，不同碰撞能量下定量离子和定性离子的响应强度见表 2和图 5，当碰撞能量为35 V时，定量离子和定性离子均有高的响应，检测灵明度高，因此最终碰撞能量选择35 V。
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表 2 不同碰撞能量下离子响应强度 Table 2 Ion response strength under different collision energy |
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图 5 不同碰撞能下N，N-二甲基苯胺裂解的总离子流图 Figure 5 Total ion current of N, N-dimethylaniline fragmentation under different collision energy |
氟胞嘧啶峰与N，N-二甲基苯胺峰完全分离，氟胞嘧啶对N，N-二甲基苯胺测定无干扰，见图 1。
2.3.2 线性关系精密称取N，N-二甲基苯胺对照品25.02 mg，置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液；取对照品储备液，逐级稀释，制成质量浓度分别为10、5、2.5（限度值）、1、0.4 ng·mL-1的对照品溶液，进样分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，结果线性方程：
Y=701.1X+57.55 r=0.999 5
结果表明，基因毒性杂质N，N-二甲基苯胺质量浓度在0.4~10 ng·mL-1范围内，与峰面积呈线性关系。
2.3.3 检测限与定量限取2.3.2项下对照品储备液适量，以流动相稀释制得质量浓度分别为0.4 ng·mL-1和0.1 ng·mL-1的对照品溶液，进样分析。测得N，N-二甲基苯胺的定量限为0.4 ng·mL-1（S/N=9.8），相当于可定量检测样品中0.000 004%水平的N，N-二甲基苯胺；检测限为0.1 ng·mL-1（S/N=3.7），相当于可检出样品中0.000 001%水平的N，N-二甲基苯胺。图谱见图 6。
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1.N，N-二甲基苯胺（N，N-dimethylaniline） 图 6 N，N-二甲基苯胺定量限（A）和检测限（B） Figure 6 LOQ (A)and LOD (B)of N, N-dimethylaniline |
取样品（批号AB-1411001）约100 mg，共9份，精密称定，分别置10 mL量瓶中，加入限度值浓度80%、100%和200% 3个浓度水平（2、2.5、5 ng·mL-1）的N，N-二甲基苯胺对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每个浓度水平3份溶液；进样分析。结果见表 3，平均回收率（n=9）为101.3%，RSD为4.3%。
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表 3 N，N-二甲基苯胺回收率 Table 3 Recoveries of N, N-dimethylaniline |
取2.5 ng·mL-1的对照品溶液分别在0、2、4、6、8、12 h进样分析。结果6个时间点峰面积的RSD为1.3%，说明溶液稳定。
2.4 样品测定取3批样品（批号AB-1410001、AB-1410002、AB-1411001）各约100 mg，精密称定，分别置10 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，进样分析；另取流动相溶液和限度浓度N，N-二甲基苯胺对照品溶液进样分析。结果见表 4，图谱见图 7。3批氟胞嘧啶中基因毒性杂质N，N-二甲基苯胺残留测定结果，远低于限度值0.000 025%。
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表 4 氟胞嘧啶中基因毒性杂质N，N-二甲基苯胺残留测定结果 Table 4 The result of residue determination about genotoxic impurity N, N-dimethylaniline in flucytosine |
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1.N，N-二甲基苯胺（N，N-dimethylaniline）A.限度值浓度N，N-二甲基苯胺对照品溶液（limit concentration N，N-dimethylanilinereference substance）B.空白溶液（blank solvent）C.样品（sample） 图 7 N，N-二甲基苯胺检测的MRM图谱 Figure 7 The MRM chromatogramsof N, N-dimethylaniline |
用LC-UV法检测，N，N-二甲基苯胺的定量限为0.02%，而氟胞嘧啶中基因毒性杂质N，N-二甲基苯胺的限度为0.000 025%，说明紫外检测远达不到要求，须用高灵敏度的HPLC-MS/MS法。
本方法能够对氟胞嘧啶中的痕量基因杂质N，N-二甲基苯胺进行有效控制，方法专属性强，灵敏度高，满足痕量杂质测定的要求，可作为氟胞嘧啶杂质的质控方法。
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