2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
盐酸左西替利嗪（levocetirizine hydrochloride，R-（-）-2-[2-[4-[（4-氯苯基）苯甲基]-1-哌嗪基]乙氧基]乙酸二盐酸盐，图 1）是盐酸西替利嗪的左旋体[1]，也是西替利嗪的活性成分，为新一代组胺H1受体拮抗剂。本品用于缓解变态反应性疾病的过敏症状，在临床上继承了盐酸西替利嗪起效快和抗过敏作用强的特性[2-4]，克服了盐酸西替利嗪嗜睡等中枢神经系统副反应[5-8]。目前国内外药典均未收载盐酸左西替利嗪原料药及其制剂，英国药典收载了盐酸西替利嗪原料药，美国药典及中国药典收载了盐酸西替利嗪原料药及其制剂[9-11]。
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图 1 盐酸左西替利嗪的化学结构 Figure 1 Chemical structure of levocetirizine hydrochloride |
该品种的现行质量标准均为各生产企业的注册标准，仅部分注册标准设置了有关物质项，为评价该品种及原料药的现实水平，故对有关物质进行了研究。按拟定的有关物质检查方法对8家生产企业共23批次盐酸左西替嗪片进行有关物质测定，可检出10个杂质。经查阅文献和试验研究，有4个杂质属于英国药典中盐酸西替利嗪收载的已知杂质A、B、E和G[9]，其余均为未知杂质，其中相对保留时间为0.55的未知杂质3的量最高达到0.43%，相对保留时间为0.58的未知杂质4的量最高达0.58%，相对保留时间为1.38的未知杂质8的量最高达1.80%。鉴于有关物质对药品质量安全的重要性，本研究建立了适用于盐酸左西替利嗪片有关物质检查的高效液相色谱及电喷雾正离子化的高分辨质谱（Triple TOF）分析方法，并结合处方工艺，通过质谱综合分析鉴定其结构，并推测3个较大未知杂质的来源，为提高该品种的质量提供参考依据[13~16]。
1 仪器与试药LC20AT高效液相色谱系统（岛津）；AB Sciex Triple TOF 5600液质联用仪（AB SCIEX公司）；Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）色谱柱，Welch Xtimate C18（250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）色谱柱；XP205电子天平（Mettler Toledo公司）。
磷酸二氢钠为分析纯，四氢呋喃、甲醇及甲酸均为色谱纯，水为纯化水；盐酸左西替利嗪片（规格：5 mg；国内抽验样品共23批，涉及8家生产企业）；盐酸西替利嗪EP杂质（Molcam Corporation）：杂质A为（RS）-1-[（4-chlorophenyl）phenylmethyl]piperazine，杂质B为（RS）-2-[4-[（4-chlorophenyl）phenylmethyl]piperazine-1-yl] acetic acid，杂质C为（RS）-2-[2-[4-[（2-chlorophenyl）phenylmethyl] piperazine-1-yl] ethoxy] acetic acid，杂质D为1，4-bis [（4-chlorophenyl）phenylmethyl] piperazine，杂质E为（RS）-2-[2-[2-[4-[4-chlorophenyl）phenylmethyl] piperazin-1-yl] ethoxy]ethoxy] acetic acid（ethoxycetirizine），杂质F为2-[2-[4-（diphenylmethy）piperazin-1-yl]ethoxy]acetic acid，杂质G为（RS）-2-[4-[（4-chlorophenyl）phenylmethyl] piperazine-1-yl] ethan-1-ol。
2 方法与结果 2.1 探索性研究拟定的有关物质检查方法 2.1.1 色谱条件色谱柱：Welch Xtimate C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-四氢呋喃-磷酸盐溶液（磷酸二氢钠3.1 g，用水溶解稀释至1 000 mL，用磷酸调节pH至2.9）（44.5:5.5:50）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：231 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。
2.1.2 溶液的制备 2.1.2.1 供试品溶液取样品5片量，置25 mL量瓶中，加流动相适量振摇使盐酸左西替利嗪溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.1.2.2 对照溶液精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.1.2.3 空白辅料溶液取收集到的所有片剂生产企业处方中各成分的量除盐酸左西替利嗪外制成混合空白辅料，再按供试品溶液的制备方法制成空白辅料溶液。
2.1.3 结果按拟定的有关物质检查方法对8家生产企业共23批次盐酸左西替嗪片进行有关物质测定，可检出10个杂质。按照不加校正因子自身对照法计算杂质量，其中相对保留时间为0.55的未知杂质的量最高达到0.43%，相对保留时间为0.58的未知杂质的量最高达0.58%，相对保留时间为1.38的未知杂质的量最高达1.80%。
2.2 探索性研究的LC-MS方法 2.2.1 色谱及质谱条件 2.2.1.1 色谱条件色谱柱：Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：A相为水（含0.05%甲酸），B相为甲醇（含0.05%甲酸），线性梯度洗脱（0~5 min，50%B；5~15 min，50%B→60%B）；流速：0.3 mL·min-1；进样体积：2 μL。
2.2.1.2 质谱条件电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式；一级质谱扫描范围100~2 000 m/z，二级质谱扫描范围6MS/MS，each 50~1200 m/z，IDA。
2.2.2 溶液的制备 2.2.2.1 盐酸左西替利嗪片供试品溶液取盐酸左西替利嗪片粉适量（约相当于盐酸左西替利嗪5 mg），加入甲醇-水（50:50）1 mL，超声（500 W，40 kHz）2 min助溶，微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
2.2.2.2 盐酸西替利嗪EP杂质溶液取盐酸西替利嗪EP杂质A~G各约5 mg，加入甲醇-水（50:50）1 mL，超声（500 W，40 kHz）2 min助溶，微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
2.2.3 LC-MS/MS分析分别取盐酸左西替利嗪片供试品溶液及盐酸西替利嗪EP杂质溶液，按“2.1.1”项条件进行检测，样品共检出10个杂质，其中4个为EP中的已知杂质A、B、E、G。不同生产企业由于生产工艺不同，杂质的检出个数略有不同。图 3为其中1家企业样品的基峰图（Base Peak Chromatogram，BPC）及UV图，根据各杂质的一级及二级质谱图（图 4~12），并结合处方分析，分别推测出该企业样品中杂质的结构（表 1）。另外，由于杂质3、4及杂质8普遍存在于各企业样品中，且部分企业样品中这些杂质含量较高，所以本文也重点阐述了对这3个杂质结构进行确证的推理过程、裂解途径；并结合处方分析，推断出其生成途径。
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图 2 盐酸左西替利嗪片样品溶液基峰图及紫外色谱图 Figure 2 BPC and UV spectrum of sample solution of levocetirizine hydrochloride tablets |
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图 3 杂质1的一级质谱图（A）和二级质谱图（B） Figure 3 Original spectrum(A)and fragment ions spectrum(B)of impurity 1 |
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图 4 杂质2的一级质谱图（A）和二级质谱图（B） Figure 4 Original spectrum(A)and fragment ions spectrum(B)of impurity 2 |
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图 5 杂质5的一级质谱图（A）和二级质谱图（B） Figure 5 Original spectrum(A)and fragment ions spectrum(B)of impurity 5 |
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图 6 杂质6的一级质谱图（A）和二级质谱图（B） Figure 6 Original spectrum(A)and fragment ions spectrum(B)of impurity 6 |
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图 7 杂质7的一级质谱图（A）和二级质谱图（B） Figure 7 Original spectrum(A)and fragment ions spectrum(B)of impurity 7 |
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图 8 杂质9的一级质谱图（A）和二级质谱图（B） Figure 8 Original spectrum(A)and fragment ions spectrum(B)of impurity 9 |
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图 9 杂质10的一级质谱图（A）和二级质谱图（B） Figure 9 Original spectrum(A)and fragment ions spectrum(B)of impurity 10 |
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图 10 盐酸左西替利嗪的一级质谱图（A）和二级质谱图（B） Figure 10 Original spectrum(A)and fragment ions spectrum(B)of levocetirizine hydrochloride |
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表 1 盐酸左西替利嗪片有关物质质谱检测结果 Table 1 Mass-spectra results of the related substances in Levocetirizine Hydrochloride tablets |
针对3个较大杂质（未知杂质3、4和8）的二级质谱碎片信息推测其裂解规律，结合处方工艺推测其结构和杂质的来源。
未知杂质3和4的一级质谱图中（图 11，A），其中m/z 713.269 4、m/z 735.252 2分别为杂质3和4的[M+H]+，[M+Na]+的峰，可推测它们的相对分子质量为712，以C、H、O、N和Cl在1×10-6的偏差范围内，拟合元素组成，可得其化学式为C33H45O13N2Cl，相比左西替利嗪（C21H25O3N2Cl）分子式多了C12H20O10。从二级质谱图中（图 11-B、C），还可以看到杂质3与杂质4的裂解图谱完全一致，并且皆具有左西替利嗪裂解的主要碎片离子，如m/z 389、m/z 201、m/z 166，可推测两者为同分异构体，且皆含有左西替利嗪的母体结构，只是连接了1个分子式为C12H20O10的结构片段。进一步结合处方分析，检出未知杂质3和4的生产企业的处方中均含有乳糖，推测杂质3与杂质4是左西替利嗪的羧基与乳糖不同位置的羟基产生的酯化产物，随后通过文献查阅也进一步验证了推测[12]。但由于乳糖上参与酯化反应的羟基位置难以确定，所以杂质3与杂质4的准确结构还需借助其他办法，暂且以通式的形式，阐述杂质3与杂质4的裂解途径（见图 11-D）。
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图 11 杂质3/杂质4的一级质谱图（A）、杂质3的二级质谱图（B）、杂质4的二级质谱图（C）及杂质3/杂质4质谱裂解途径 Figure 11 Original spectrum of impurity 3/impurity 4 (A), fragment ions spectrum of impurity 3(B), and fragment ions spectrum of impurity 4(C)and fragmentation pathway of impurity 3/impurity 4 |
未知杂质8的一级质谱图中（见图 12），其中m/z 417.194 5、m/z 419.192 7为杂质8的[M+H]+峰及其同位素峰，可推测该杂质的相对分子质量为416，以C、H、O、N和Cl在1×10-6的偏差范围内，拟合元素组成，可得其化学式为C23H29ClN2O3。其所产生的大多数碎片离子与左西替利嗪的碎片离子一致，如m/z 201，m/z 166等。可见所研究的杂质8与左西替利嗪相比，主体结构并未发生大的变化；同时在企业调研中，得知采用乙醇湿法制粒，杂质8的含量会进一步增加；综合以上分析，推断杂质8为左西替利嗪的乙酯化产物，产生于储存过程中原料药与残留溶剂（乙醇）的酯化反应。
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图 12 杂质8的一级质谱图（A）和二级质谱图（B）及质谱裂解途径 Figure 12 Original spectrum(A), fragment ions spectrum(B)and fragmentation pathway of impurity 8 |
从上述结果可以看出，杂质8、杂质3和4为制剂中的原料药与制剂工艺中残留的溶剂或处方中的辅料在特定的条件下产生的，这也提示生产企业应进一步研究杂质产生的原因，考察制剂工艺及处方的合理性。
3 结论本实验对盐酸左西替利嗪片的有关物质进行了分析，按照不加校正因子自身对照法计算杂质量。结果表明，按照拟定的方法检验各生产企业的样品，部分生产企业的样品检出了左西替利嗪的羧基与乳糖不同位置的羟基产生的酯化产物（杂质3和4），且杂质3和4的杂质量最大分别达到0.43%和0.58%；部分生产企业的样品采用湿法制粒工艺，检出了左西替利嗪与残留溶剂（乙醇）产生的酯化产物（杂质8），其杂质量最大达到1.80%。提示各生产企业应注意处方的优化，以及对工艺中关键质控点如湿法制粒的时间及残留溶剂（如乙醇）的控制，以保证产品的稳定性。
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