2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
2. 河南省食品药品检验所, 郑州 450003
2. Henan Institute for Food and Drug Control, Zhengzhou 450003, China
硫酸卷曲霉素为碱性水溶性多肽类抗生素，具有环状多肽类结构[1]，其含有4个极相似的组分（ⅠA，ⅠB，ⅡA，ⅡB），结构式见图 1；因含多个氨基，因此可产生含不同当量硫酸根的硫酸盐产品[2]。硫酸卷曲霉素结合两分子的硫酸，卷曲霉素Ⅰ的硫酸盐理论含量为22%，卷曲霉素Ⅱ的硫酸盐理论含量为26%。为保证卷曲霉素成盐的完全，确保硫酸卷曲霉素的质量和疗效，应对其硫酸根含量加以控制。硫酸根含量测定的经典方法为重量法[3]，操作烦琐费时；2005年版中国药典为容量法[4]，操作中所用氨水对实验人员刺激性较大，且滴定终点突跃不明显，初试者不易掌握。鉴于反相离子对高效液相色谱法操作简便，在无机离子测定方面的应用已日趋广泛，本文参考有关文献[5-7]，选用蒸发光散射检测器（ELSD），经优化建立了硫酸卷曲霉素原料及其制剂的硫酸根含量测定方法，对本品硫酸根含量制定了含量参考限度，以控制产品质量，同时为提高产品质量和制定质量标准提供了参考。
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图 1 硫酸卷曲霉素结构式 Figure 1 Structural formula of capreomycin sulfate |
Waters 2695高效液相色谱仪，Alltech 2000ES蒸发光散射检测器，Empower色谱工作站，BP211D电子天平。
三氟乙酸、甲醇为色谱纯，水为去离子水。
硫酸卷曲霉素原料（批号HCS1211101、HCS1211102、HCS1211103，华北制药华胜有限公司；批号5120406、5120407、5120501，浙江海正药业股份有限公司）及注射用硫酸卷曲霉素（批号3120202，规格0.75 g，浙江海正药业股份有限公司；批号1203001，规格0.5 g；批号1104001、1204001，规格1.0 g，南宁中科药业有限责任公司；批号20100603、20110101、20110501，规格0.5 g，和力达（信阳）药业有限责任公司）。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 硫酸滴定液取硫酸3 mL，缓缓注入适量冷水中，冷却至室温，加水稀释至1 000 mL。用基准无水碳酸钠进行标定，浓度为0.054 29 mol·L-1。
2.1.2 对照品溶液精密量取硫酸滴定液适量，用水定量稀释制成含硫酸根（SO42-）0.075、0.15、0.30 mg·mL-1的溶液作为对照品溶液（1）、（2）、（3）。
2.1.3 供试品溶液称取硫酸卷曲霉素原料或注射用硫酸卷曲霉素装量差异项下内容物适量，加水制成0.8 mg·mL-1的溶液，即得。
2.2 色谱条件采用GRACE Apollo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，柱温35 ℃，以0.2 mol·L-1三氟乙酸溶液-甲醇（94：6）为流动相，流速0.6 mL·min-1，进样量为20 μL；蒸发光散射检测器漂移管温度为110 ℃，载气（氮气）流速为2.8 L·min-1。
在上述色谱条件下，取对照品溶液（2）连续进样），硫酸根离子峰面积的RSD应不大于2.0%。
2.3 专属性试验 2.3.1 辅料硫酸卷曲霉素和注射用硫酸卷曲霉素均不含辅料，氯离子在漂移管的110 ℃高温中挥发不干扰硫酸根测定，见图 2。
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A.水（water）B.0.2 mol·L-1盐酸溶液（0.2 mol·L-1 hydrochloric acid solution）C.15%过氧化氢溶液（15% hydrogen peroxide solution）D.未破坏供试品溶液（no destruction solution）E.热破坏溶液（thermal destruction solution）F.酸破坏溶液（acid destruction solution）G.碱破坏溶液（alkali destruction solution）H.氧化破坏溶液（oxidative destruction solution）I.光降解溶液（photo destruction solution） 1.硫酸根（SO42-）2.钠离子（Na+）3.未知杂质（unknown impurity）4.卷曲霉素ⅠA（capreomycinⅠA）5.卷曲霉素ⅠB（capreomycinⅠB）6.过氧化氢溶液中的杂质（impurity in hydrogen peroxide solution）7.降解产物（degradation product）8.降解产物（degradation product） 图 2 降解试验色谱图 Figure 2 HPLC-ELSD chromatograms of degradation test |
取硫酸卷曲霉素原料（批号HCS1211101）80 mg，加水溶解并稀释至50 mL，备用。精密吸取该溶液5 mL，水浴中加热60 min，用水定容至10 mL，即得热破坏溶液；精密吸取该溶液5 mL，加1 mol·L-1盐酸2.5 mL，室温放置60 min后，加1 mol·L-1氢氧化钠溶液2.5 mL中和，即得酸破坏溶液；精密吸取该溶液5 mL，加1 mol·L-1氢氧化钠溶液2.5 mL，室温放置60 min后，加1 mol·L-1盐酸2.5 mL中和，即得碱破坏溶液；精密吸取该溶液5 mL，加30%过氧化氢溶液3 mL，室温放置60 min后，加水2 mL，混匀，即得氧化破坏溶液；精密吸取该溶液5 mL，于4500 lx光照24 h后用水稀释至10 mL，即得光破坏溶液。
将上述5份破坏后的溶液分别进样20 μL，记录色谱图，结果卷曲霉素在热、酸、碱、氧和光照条件下降解产物对硫酸根测定均无干扰，表明本法测定硫酸根专属性良好，见图 2。
2.4 线性关系考察精密吸取硫酸滴定液（0.054 29 mol·L-1）适量，分别加水制成0.299 8、0.223 6、0.149 9、0.117 1、0.075 1和0.015 0 mg·mL-1的对照品溶液，进样20 μL，记录色谱图；对质量浓度的对数值与相应的硫酸根峰面积对数值进行回归，回归方程：
Y=1.886X+8.061 r=0.997 8
线性范围为0.015~0.30 mg·mL-1。
2.5 检测限与最低定量限测定分别取0.015 0 mg·mL-1硫酸对照品溶液40和45 μL进样测定，其检测限与定量限分别为0.30 μg（信噪比为3）和0.68 μg（信噪比为10）。
2.6 精密度试验取低（0.075 1 mg·mL-1）、中（0.149 9 mg·mL-1）、高（0.299 8 mg·mL-1）浓度的硫酸对照品溶液，分别进样3次，计算硫酸根峰面积的RSD分别为1.0%、0.7%和0.4%；取0.149 9 mg·mL-1浓度的硫酸对照品溶液，一天内重复进样6次，日内RSD为0.3%；表明进样精密度良好。
2.7 加样回收率试验精密称取批号为HCS1211102的硫酸卷曲霉素原料9份，分别精密加入硫酸滴定液（0.054 29 mol·L-1）1.970、2.815和3.660 mL，然后加水稀释至100 mL，进样后，记录色谱图。按硫酸标准曲线计算测求得硫酸的量，计算低、中、高浓度回收率（n=3）分别为100.2%、102.8%和101.8%，RSD为0.1%~1.3%。
2.8 溶液稳定性取0.8 mg·mL-1的注射用硫酸卷曲霉素的供试品溶液，在室温（25 ℃）下于0~12 h，每隔1 h进样1次，结果硫酸根在12 h内的峰面积RSD为0.99%，说明供试品溶液稳定性良好。
2.9 耐用性 2.9.1 色谱柱考察了不同品牌色谱柱[TSK-gel ODS-81Ts（Made in Japan）C18、GRACE Apollo C18、Thermo Scientific BDS Hypersil-C18、YMC Pack Pro C18 RS、VenusilASB C18、Gemini-NX C18、GRACE Alltima HP C18 HL和Thermo Scientific Syncronis C18]，结果硫酸根与其他色谱峰均分离良好。
2.9.2 缓冲盐浓度、流动相pH和柱温曾考察了缓冲盐浓度（0.19、0.21 mol·L-1）、流动相pH（0.8、1.0）和柱温（33、37 ℃）的微小变动对硫酸根与其他色谱峰分离的影响，结果均无影响。
2.10 样品中硫酸根含量测定精密量取对照品溶液（1）、（2）、（3）各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算对照品溶液浓度的对数值与相应的主峰面积对数值的线性回归方程，相关系数（r）应不小于0.99；另取供试品溶液，同法测定，用线性回归方程计算样品中硫酸根的含量，见表 1。原料及其制剂的硫酸根含量为19.3%~23.3%，硫酸分子数为1.7~2.0。同时按照中国药典2005年版硫酸庆大霉素的容量法进行硫酸根含量测定，原料及其制剂的硫酸根含量为19.0%~23.1%，见表 1。
对滴定法和HPLC-ELSD法的硫酸根测定结果，采用配对样品t检验，sig.=0.668 > 0.05，表明2种方法在95%的可信区间，测定结果无显著性差异。
2.11 硫酸根限度标准的确定硫酸卷曲霉素含两分子的硫酸根，硫酸卷曲霉素Ⅰ的硫酸根理论含量为22%，硫酸卷曲霉素Ⅱ的硫酸根理论含量为26%，目前硫酸卷曲霉素中卷曲霉素Ⅰ归一化含量不低于98%，卷曲霉素Ⅱ的含量很少，小于2%。因此，按照卷曲霉素Ⅰ的理论含量22.4%的±5%计算为21.3%~23.5%，同时结合硫酸卷曲霉素原料及其制剂的硫酸根含量，建议将硫酸卷曲霉素中硫酸根含量限度制订为21.0%~24.0%。
3 讨论 3.1 色谱峰的鉴别硫酸卷曲霉素为发酵生产工艺，产品中残留微量Na+、Cl-，因此曾对色谱峰进行了鉴别：分别取硫酸、硫酸钠和氯化钠适量以水配成适当浓度的溶液进样分析，主峰（SO42-）的保留时间均相同，SO42-与Na+、Cl-均达到基线分离。
3.2 样品溶剂和供试品溶液浓度的选择反相离子对色谱中一般以流动相作溶剂为宜，加以水为溶剂会产生系统峰。但硫酸卷曲霉素在水中易溶，同时由于供试品溶液进入蒸发光散射检测器时在喷雾口水全部雾化，因此对样品中硫酸根的测定无影响，故选择水作溶剂。对应于线性范围测定中的3份溶液，中间浓度的硫酸对照品溶液的质量浓度为0.15 mg·mL-1，与0.8 mg·mL-1硫酸卷曲霉素供试品溶液中的硫酸根峰面积相当，因此供试品溶液浓度定为0.8 mg·mL-1。
3.3 硫酸卷曲霉素的成盐率硫酸卷曲霉素目前生产工艺包括2种，一种是喷雾干燥无菌粉末直接分装，其性状为“白色或类白色粉末”；一种是使用发酵浓缩液直接冻干，浓缩液作为中间品管理。原料及其制剂的硫酸根含量为19.3%~23.3%，计算其硫酸分子数为1.7~2.0，而硫酸卷曲霉素理论含两分子的硫酸根，某些批次原料与制剂硫酸根含量较低，说明其成盐不完全。查询文献[8]与河南省不良反应中心信息，注射用硫酸卷曲霉素由于肌注局部疼痛、硬结的不良反应较大，病人难以耐受，而成盐不完全会影响其吸收，进而影响其临床不良反应与有效性。因此，有必要控制硫酸根的含量。
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表 1 硫酸卷曲霉素及其制剂检验数据 Table 1 Results of sulfate in capreomycin sulfate and its preparation |
传统滴定法测定硫酸根的含量，虽然成本低廉，但是操作过程烦琐，影响因素多。滴定过程需要始终保持供试品溶液的pH为11，调节pH时还应注意避免反应离子及待测离子的损失，因此滴定耗时比较长；pH的差异与乙醇加入时机的掌握影响滴定终点的灵敏度；同时在滴定过程中产生白色硫酸钡沉淀，使对滴定终点的判断较为困难。而HPLC-ELSD法测定硫酸根含量，方法专属性强，准确度与精密度良好，方法简便易操作，克服了滴定法目视判断滴定终点的不足，能更为准确地对硫酸根的含量进行测定。
3.5 对照品溶液的选择中国药典2015年版中硫酸滴定液是以基准无水碳酸钠进行标定，因此标定出的浓度与硫酸根是对应的，HPLC-ELSD采用硫酸滴定液作为对照品溶液可以直接溯源到基准物质无水碳酸钠，因此该方法准确度可靠并良好。
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