2017, Vol. 37 
促黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）免疫分析广泛应用于辅助诊断下丘脑、脑垂体和性腺功能障碍，监测疗效，也可用于更年期的确认，鉴别排卵期和研究青春期失调等[1-4]。人垂体LH第2次国际标准品（2nd IS LH，批号80/552）建立于1988年[5]，是各种LH免疫分析试剂盒校准品的标准品和溯源时使用的一级标准品，广泛用于全世界范围内免疫测定人血清和血浆中LH方法的校准。由于该批标准品存量几乎耗尽，亟需更换，因此在2013年底，WHO开展了免疫分析用人LH第3次国际标准品的国际协作标定，以评价其作为国际标准品的可行性。该次协作标定的主要目的：（1）采用免疫分析方法，以现行2nd IS LH（批号80/552）标定LH候选国际标准品（批号81/535）；（2）评价候选国际标准品（批号81/535）作为第3次LH免疫分析用国际标准品的稳定性。全球共有7个国家的11个实验室参加协作标定工作，本实验室代表中国实验室参加了此次国际标准物质协作标定研究。
1 实验材料 1.1 标准品现行LH国际标准品（2nd IS LH，批号80/552，35 IU·安瓿-1）为本次协作标定的核心样本，0.5 mL·安瓿-1，每安瓿含LH提取物、5 mg甘露醇、1 mg人血白蛋白和90 μg氯化钠的溶液冻干后残余物。经检测，HBsAg、抗-HIV和HCV NAT阴性。
1.2 样本第3次LH国际标准品候选品（批号81/535，理论效价为35 IU·安瓿-1）相关的7种样本，安瓿内容物来源与第2次LH国际标准品（批号80/552）一致，均由同一批捐赠的垂体LH制备而成，0.5 mL·安瓿-1，每安瓿含LH5.8 μg提取物、5 mg甘露醇、1 mg人血白蛋白和90 μg氯化钠的溶液冻干后残余物。经检测，HBsAg、抗-HIV和HCV NAT阴性。7种样本均以字母编号并给出理论效价，具体编号、效价详见表 1。WHO根据各机构的检测能力和样本的可提供性分发样本。本实验室被分派到除2nd IS LH 80/552之外的4种待测样本（编号分别为B、C、F、G）。
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表 1 协作标定中提供给参加者的样本 Table 1 Ampouled preparations provided to participants in collaborative study |
碘[125I]人促黄体生成激素放射免疫分析药盒，北京北方生物技术研究所生产；促黄体生成激素（LH）定量检测试剂盒（磁微粒分离酶联免疫法），北京倍爱康生物技术有限公司生产；人促黄体生成激素（hLH）定量检测试剂盒（时间分辨免疫荧光分析法），广州市达瑞抗体工程技术有限公司生产；促黄体生成素测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法），雅培贸易（上海）有限公司生产；促黄体生成素检测试剂盒（化学发光法），贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司生产。
1.4 分析缓冲液0.01 mol·L-1 PBS缓冲液，含0.1% BSA，pH 7.2~7.4，用于样本的复溶。
2 WHO对国际协作标定实验的要求 2.1 实验操作安瓿样本在使用前应一直在-20 ℃以下保存。开瓶前，需将安瓿恢复至室温以减少水分吸收。每支安瓿内容物应采用适当的含蛋白缓冲液3.5 mL充分溶解，得到10 IU·mL-1（理论上）原液，然后再用于配制各系列的剂量-反应曲线溶液。各参加实验室至少完成2次独立分析，每次独立分析均应包含分配的所有样品；每条剂量-反应曲线至少应包含5个剂量水平，且每个水平至少2次重复。
2.2 实验记录各实验室需提供安瓿复溶及每步稀释的详细步骤。因多数情况下安瓿内溶液不是复溶之后立即用于检测，因此建议采用冻干原液制备新鲜稀释液。各实验室应提供所使用分析方法的详细情况和OD值、发光值等所有的原始实验数据，并以电子版的形式提交给英国国家生物制品检定所（NIBSC）中央计算机处理系统，同时提交计算的LH浓度估计值以及本实验室中通常使用的计算方法。
3 实验方法本次协作标定实验过程中严格按照WHO的要求进行操作。
3.1 样品复溶与系列溶液配制WHO分派的所有安瓿样本均用3.5 mL分析缓冲液复溶，得到浓度为10 IU·mL-1溶液，再根据各试剂盒的线性范围，采用各试剂盒零校准品或者专用稀释液，分别稀释至如下溶液：碘[125I]人促黄体生成激素放射免疫分析药盒和人促黄体生成激素（hLH）定量检测试剂盒（时间分辨免疫荧光分析法）：300、150、75、37.5、18.75、9.375 mIU·mL-1；促黄体生成激素（LH）定量检测试剂盒（磁微粒分离酶联免疫法）：100、50、25、12.5、6.25、3.125 mIU·mL-1；促黄体生成素测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）：150、75、37.5、18.75、9.375、4.687 5 mIU·mL-1；促黄体生成素检测试剂盒（化学发光法）：200、100、50、25、12.5、6.25 mIU·mL-1。
3.2 剂量-反应曲线制作各方法的每次独立实验中，都配制1条标准品（2nd IS LH，80/552）、4条待测样品（LH，81/535）以及1条试剂盒校准品的剂量-反应曲线；每条剂量-反应曲线含5~6个剂量水平，每个剂量水平重复测定2次。
3.3 实验操作所有免疫分析操作按各试剂盒说明书提供的方法进行。
3.4 数据处理放射免疫分析法采用log（dose）-logit（B/B0）数学模型拟合，其余双抗体夹心法免疫分析用双对数log（dose）-log（cpm/OD/RLU）数学模型拟合。各待测样本（LH，81/535）与相应浓度的2nd IS LH 80/552同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，采用t检验分析各待测样本与2nd IS LH 80/552的剂量-反应曲线是否平行（平行表明待测样本与标准品为同质样本，方可进行比较）。在平行的前提下，以2nd IS LH 80/552剂量-反应曲线为标准曲线，计算各样本的实测值与理论值的效价比，最终得到各样本的效价。t检验结果不平行的样本，则不进行效价比的计算。
4 实验结果 4.1 待测样品（LH，81/535）的效价以2nd IS LH（80/552）为标准品，计算各待测样品（LH，81/535）的效价。按照“3.4”项中的数据处理方法进行分析计算后，不同免疫分析方法的测定效价详见表 2。“WHO汇总数据（以几何均数表示）”行的数据摘自《WHO人垂体促黄体生成激素第3次国际标准品国际协作研究》报告。结果表明：本实验室上报数据与WHO汇总数据之间相对偏差在-2.3%~6.9%范围内，合并安瓿C和安瓿G（因C和G为同一样本）数据后，结果为34.2 IU·安瓿-1，在WHO汇总数据95%可信限（32.1~34.3 IU·安瓿-1）范围内。
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表 2 以2nd IS LH 80/552计算各LH 81/535样品免疫效价平均值（IU·安瓿-1） Table 2 Mean estimates of LH immune potency in IU per amp of LH81/535, calculated relative to 2nd IS LH80/552(IU per ampoule) |
WHO通过拟合平行线模型比较log（分析反应）对log（浓度）评价线性，平行性通过参考和待测样本的斜率比值进行评价，比值在0.80~1.25之外认为无效。各实验室平均结果以未加权几何平均值计算，整体平均结果以实验室平均结果的未加权几何平均值计算。本实验室编号为4。以2nd IS LH 80/552为对照，LH81/535免疫效价测定值在各实验室测定结果中的情况见图 1。
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4a~4e分别代表不同检测方法（4a~4e represent different detection methods respectively） 图 1 各实验室以2nd IS LH 80/552计算各LH 81/535样品免疫效价平均值（IU·安瓿-1）结果图 Figure 1 The results of each laboratory for LH immune potency estimates in IU per amp for LH 81/535, calculated relative to 2nd IS LH 80/552 |
以贮存于-20 ℃的LH 81/535为对照，计算各热加速降解样品（37 ℃和4 ℃加速26年）与其的相对偏差，结果表明，4 ℃放置26年，效价下降幅度较小，仅2.4%，但在37 ℃条件下，放置26年，效价下降了25.3%。WHO未分派给本实验室贮存于4 ℃、37 ℃和45 ℃的2年的3个热加速降解样品，故本实验室无该项数据。
WHO对于候选品稳定性的分析方法是，假定加速热降解样品的相对免疫反应为一阶衰减，采用阿伦尼乌斯方程中有关降解率与绝对温度进行拟合，从而预测当存储在一个温度范围内的降解率。《WHO人垂体促黄体生成激素第3次国际标准品国际协作研究》的报告中，根据各实验室提供的数据分析表明，-20 ℃保存时预计年降解率为0.014%，4 ℃保存时预计年降解率为0.129%。表明在-20 ℃和4 ℃保存条件下，标准品稳定，效价无明显降低。根据以上结果，WHO认为该候选品稳定性满足要求。
5 结论7个国家11个实验室共同完成了本次协作标定，本实验室所得数据满足WHO要求，均被采纳。WHO统计组把所有测得数据汇总进行分析处理。候选的国际标准品LH 81/535与2nd IS LH 80/552系来自同一批垂体原料[6-7]，且经加速稳定性实验证明，性质稳定，因此，认为将LH 81/535作为第3次国际标准品是适宜的。2014年10月，人垂体促黄体生成激素第3次国际候选标准品（批号81/535）由WHO生物标准专家委员会通过，作为第3次国际标准品使用，LH免疫效价为33 IU·安瓿-1。
6 讨论 6.1 LH及其免疫分析人促黄体生成激素（human luteinizing hormone，hLH）是由脑垂体前叶分泌的一种糖蛋白类促性腺激素。hLH分子由2条非共价连接的不同肽链（α和β）组成，α链与人促甲状腺激素（hTSH）、人促卵泡激素（hFSH）及人绒毛膜促性腺激素（hCG）相似，但β链具有特异性，决定hLH的生物活性。其生理功能在男性体内主要是促进睾丸间质细胞增生，分泌雄激素，在女性体内则主要是促进排卵的发生[8-12]。
目前临床检测方法有放射免疫法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫法和化学发光免疫法[13-14]、胶体金等。前4种多为定量测定方法，胶体金多为定性或者半定量。在这次国际协作研究中，本实验室选用了前4种方法的试剂，且既包括国产试剂也包括进口试剂。这不仅为本次国际协作研究方法的多样性提供了数据，而且通过比较本实验室上报数据与WHO汇总数据，为我们考察国内定量标记免疫分析试剂盒的质量提供了很好的数据支持。
6.2 LH免疫分析测定的标准化NIBSC是WHO的国际标准品供应中心实验室之一，其核心工作是制备、保存和分发WHO用于检测全球生物制品质量的标准物质。对于免疫学检测中的项目如激素类、蛋白类等，由于没有建立公认的参考方法，大多采用多中心定值的方法，即综合各实验室不同方法间得到的结果，采用适当的统计方法进行分析，从而确定标准品候选品效价。这次LH国际标准品候选品研究也依然采用了这样的方式。这种处理方式，在一定程度上的确可以减小不同免疫分析方法间测定结果差异，但是并不能完全解决标准化的问题，只能说是促进标准化的方法之一。究其原因，是因为免疫分析的标准化还是相当困难的，因为它涉及到标记免疫分析各基本要素的标准化和试验系统的合理设计。各要素包括抗原纯度及特异性；抗体效价、特异性和亲和力；测定原理和技术的不同；数据处理的曲线拟合方式差异；校准品的溯源性；样本的收集与处理方法；基质效应等[15-16]。NIBSC提出在未来也许可采用追溯到LH（批号81/535）的人血清基质相适应的参考盘，协调减小LH免疫分析方法之间的变异。因此，标准化之路任重道远，需要各方的努力。
致谢：本协作研究工作得到了北京北方生物技术研究所、北京倍爱康生物技术有限公司、广州市达瑞抗体工程技术有限公司、雅培贸易（上海）有限公司生产和贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司的大力协助。
| [1] |
PAULINE C, ALLAN EH. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(51): 18387. DOI:10.1073/pnas.1415226112 |
| [2] |
袁媛, 苗本郁, 麦庆云, 等. 超排卵全程应用225U促黄体生成素对取卵及胚胎移植日血清血管内皮生长因子水平的影响[J]. 中山大学学报医学科学版, 2015, 36(2): 227. YUAN Y, MIAO BY, MAI QY, et al. Whole course 225 U recombinant luteinizing hormone application can decrease serum vascular endothelial growth factor level on oocyte pick-up and embryo transfer day[J]. J Sun Yat-sen Univ Med Sci, 2015, 36(2): 227. |
| [3] |
牛海燕, 郭艺红. 重组人促黄体生成素在IVF促排卵中的研究[J]. 河南医学研究, 2014, 23(3): 90. NIU HY, GUO YH. The research of recombinant human luteinizing hormone in IVF promoting ovulation[J]. Henan Med Res, 2014, 23(3): 90. |
| [4] |
周雪莲, 傅君芬, 金菊花, 等. 肥胖对中枢性性早熟女童GnRH激发试验促黄体生成素峰值及相关激素的影响[J]. 中国当代儿科杂志, 2015, 7(8): 763. ZHOU XL, FU JF, JIN JH, et al. Effects of obesity on peak level of luteinizing hormone in gonadotropin-releasing hormone agonist test and obesity-related hormones in girls with central precocious puberty[J]. Chin J Contemp Pediatr, 2015, 7(8): 763. DOI:10.7499/j.issn.1008-8830.2015.08.001 |
| [5] |
STORRING PL, GAINES DAS RE. The second International Standard for Human Pituitary LH:its collaborative study by bioassays and immunoassays[J]. J Endocrinol, 1993, 138(2): 345. DOI:10.1677/joe.0.1380345 |
| [6] |
LOEBER JG. Human luteinizing hormone:structure and function of some preparations[J]. Acta Endocrinol Suppl(Copenh), 1977, 210: 3. |
| [7] |
CLOSSET J, VANDALEM JL, HENNEN G, et al. Human luteinizing hormone.Isolation and characterization of the native hormone and its alpha and beta subunits[J]. Eur J Biochem, 1975, 57(2): 325. DOI:10.1111/ejb.1975.57.issue-2 |
| [8] |
PALERMO R. Differential actions of FSH and LH during folliculogenesis[J]. Reprod Biomed Online, 2007, 15(3): 326. DOI:10.1016/S1472-6483(10)60347-1 |
| [9] |
熊芳, 周萍, 胡玲卿, 等. 重组促黄体生成素在卵巢储备正常患者超促排卵中的作用[J]. 中国妇幼保健, 2016, 31(2): 336. XIONG F, ZHOU P, HU LQ, et al. The role of recombinant luteinizing hormone in ovarian hyperstimulation for patients with normal ovarian reserve[J]. Matern Child Health Care China, 2016, 31(2): 336. |
| [10] |
吴彦霖, 张媛, 刘倩, 等. 第5批人黄体生成素国际标准品的协作标定[J]. 药物分析杂志, 2015, 35(10): 1736. WU YL, ZHANG Y, LIU Q, et al. A collaborative study of the proposed 5th international standard reference for human urinary luteinizing hormone[J]. Chin J Pharm Anal, 2015, 35(10): 1736. |
| [11] |
周碧云. 促黄体生成激素酶促化学发光免疫分析方法的建立[J]. 中国医疗前沿, 2013, 8(11): 79. ZHOU BY. The establishment of enzymatic chemiluminescence immunoassay method for luteinizing hormone[J]. Natl Med Front China, 2013, 8(11): 79. DOI:10.3969/j.issn.1673-5552.2013.11.0058 |
| [12] |
邓智标. 血清睾酮/促黄体生成素、促卵泡激素及促黄体生成素水平检测在诊断睾丸生精作用中的价值[J]. 国际检验医学杂志, 2016, 37(11): 1508. DENG ZB. Value of serum T/LH, FSH and LH levels in the diagnosis of testicular spermatogenesis[J]. Int J Lab Med, 2016, 37(11): 1508. DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.023 |
| [13] |
林冠峰, 邹丽萍, 刘天才, 等. 人促黄体生成素光激化学发光免疫分析法的建立[J]. 热带医学杂志, 2012, 12(5): 566. LIN GF, ZOU LP, LIU TC, et al. Development of AlphaLISA for the detection of luteinizing hormone in human serum[J]. J Trop Med, 2012, 12(5): 566. |
| [14] |
刘庸. 标记免疫分析的标准化与临床应用[J]. 中华医学信息导报, 2002(10): 9. LIU Y. Standardization and clinical application of labeled immunoassay[J]. China Med News, 2002(10): 9. |
| [15] |
黄颖. 标记免疫分析的质量控制和标准化(一)[J]. 标记免疫分析与临床, 2006, 13(3): 171. HUANG Y. Quality control and standardization of labeled immunoassay(Ⅰ)[J]. Labeled Immunoassays Clin Med, 2006, 13(3): 171. |
| [16] |
黄颖. 标记免疫分析的质量控制和标准化(二)[J]. 标记免疫分析与临床, 2006, 13(4): 240. HUANG Y. Quality control and standardization of labeled immunoassay(Ⅱ)[J]. Labeled Immunoassays Clin Med, 2006, 13(4): 240. |