2017, Vol. 37 
据《中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册》[1]和《维吾尔药材标准》[2]等记载，阿纳其根系菊科（Compositae）植物罗马除虫菊（Anacyclus pyrethrum DC.）干燥的根，维吾尔药名为阿克尔开尔哈，别名为阿吉而哈而哈、欧都里开日合、比合台尔混库依[3]，主要分布于北非或南部欧洲，我国新疆亦有分布。原植物罗马除虫菊为多年生草本，高15~45 cm，多具长柔毛，在春秋季采挖，洗净，切断，晒干。其性味为三级末四级首干热，具有生干生热、祛寒强筋、开通阻滞、祛风止痛、燥湿化痰、滋补神经等功效；在维吾尔医中，主要用于白癜风、肿瘤、膝骨关节炎等疾病的治疗[1-4]，尤其是在治疗白癜风方面具有显著的疗效[4-6]。
目前，对于阿纳其根的化学成分研究甚少，已有的文献报道，主要是集中在对其N-烷基类成分[7-8]的分析，Jente等[9]从阿纳其根中分离到了4个N-烷基化合物；Boonen等[10]采用HPLC/UV-ESI/MS对阿纳其根的乙醇提取物中N-烷基类成分进行了分析，共鉴别了10余种该类成分。本实验室前期分离得到的化合物十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺和十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺（结构式见图 1），属于N-烷基类成分中的4-羟基-苯乙酰胺类；据文献[11-12]报道，化合物十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺和十二-2E < /span > ，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺均具有激活酪氨酸酶活性的作用，且十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺对酪氨酸酶激活率高于阳性对照药（8-甲氧补骨脂素）。文献检索未见用HPLC法同时测定两者的含量，故本实验采用反相高效液相色谱法同时测定阿纳其根中十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺和十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺成分的含量，考察3批阿纳其根药材中2种成分的含量差异，为阿纳其根药材的质量控制及进一步的研究提供一定的依据。
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图 1 十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺（A）与十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺（B）结构式 Figure 1 Structures of deca-2E, 4E-dienoic acid 4-hydroxyphenylethylamide(A)and dodeca-2E, 4E-dienoic acid-4-hydroxyphenylethylamide(B) |
LC-20A型高效液相色谱仪，配置PDA型紫外-可见检测器，四元梯度泵（岛津公司）；色谱柱Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）（Agilent Technologies）；KH-250型超声仪（昆山禾创超生仪器有限公司）。
1.2 试药十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺及十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺的对照品由本实验室采用硅胶、C18反复柱层析的方法提取分离制备得到，核磁共振谱确定结构，经HPLC-UV测定，纯度（归一化法）均达到98%以上。
甲醇为色谱纯，甲醇为分析纯，水为屈臣氏纯净水，其他试剂均为分析纯。
阿纳其根样品购自亳州市中正中药材饮片有限公司，批号为130704、140715、150708。经北京中医药大学中药学院谭鹏副教授鉴别为菊科植物罗马除虫菊（Anacyclus pyrethrum DC.）的根。
2 实验方法与结果 2.1 混合对照品溶液的制备精密称取十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺及十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺的对照品适量，加甲醇分别制成对照品母液；再分别吸取一定体积的各对照品母液于同一量瓶中，以甲醇定容得质量浓度分别为30.6 mg·L-1和17.2 mg·L-1的混合溶液，0.45 μm滤膜滤过，即得。
2.2 供试品溶液的制备取阿纳其根粉末（过3号筛）约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，称量，超声（功率600W，频率40 kHz）提取30 min，放冷，再称量，用甲醇补足减少的量，摇匀，上清液用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
2.3 色谱条件色谱柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（70:30）；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：243 nm；柱温：25 ℃。
在上述色谱条件下，对照品及样品色谱图见图 2。
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1.十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺（deca-2E，4E-dienoic acid 4-hydroxyphenylethylamide）2.十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺（dodeca-2E，4E-dienoic acid-4-hydroxyphenylethylamide） 图 2 对照品（A）和样品（B）HPLC色图谱 Figure 2 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample(B) |
精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10、20、40 μL进样，记录峰面积；以待测物质量浓度X（mg·L-1）为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺及十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺的回归方程：
Y=8.000×106X-7.609×104 r=0.999 9
Y=8.000×106X-4.935×104 r=0.999 9
表明上述两待测成分质量浓度分别在30.6~122.4 mg·L-1和17.2~68.8 mg·L-1范围内呈良好线性关系。
2.4.2 精密度试验精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积，计算十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺及十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺RSD分别为0.51%和0.50%；结果表明，仪器精密度良好。
2.4.3 稳定性试验取同一供试品溶液分别于供试品溶液制备后0、1、2、4、6、8 h依次进样，测定峰面积，记录色谱图，结果十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺及十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺的RSD分别为2.41%和1.71%，表明供试品溶液在8 h内稳定。
2.4.4 重复性试验称取同一阿纳其根样品粉末6份，每份1 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积；结果样品中十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺及十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺平均含量分别为0.050%和0.037%，RSD分别为1.21%和2.44%，表明本法重复性良好。
2.4.5 加样回收率试验分别称取已知含量（十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺0.50 mg·g-1，十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺0.37 mg·g-1）的阿纳其根样品粉末6份，每份0.5 g，精密称定，精密加入3.06 mg·mL-1十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺对照品溶液81.7 μL，1.72 mg·mL-1十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺对照品溶液95.9 μL，按“2.2”项下方法制备供试溶液，按上述色谱条件进样，记录峰面积，计算回收率，结果十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺及十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺平均加样回收率（n=6）分别为99.90%和100.4%，RSD分别为1.60%和0.85%，表明本法准确度良好。
2.5 样品含量测定精密吸取不同批次阿纳其根药材的供试品溶液液各10 μL，分别进样，记录峰面积，采用回归方程计算十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺及十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺的含量，结果见表 1。
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表 1 不同批次含量测定结果（%，n=3） Table 1 Results of content determination in different batches |
本实验对十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺和十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺2个成分进行了200~400 nm范围的全波长扫描，并分析这2个N-烷基类成分的紫外吸收光谱，结果表明两者皆在243 nm处有最大吸收，故本文选择243 nm作为检测波长。流动相分别考察了甲醇-水（60:40）、甲醇-水（70:30）、甲醇-水（72:28）和甲醇-水（75:25），结果表明，阿纳其根药材甲醇提取物以甲醇-水（70:30）分离效果最佳。
本文考察了甲醇超声提取和回流提取2种提取方法及提取时间为10、20、30、40、50、60 min等对提取率的影响，结果超声与回流2种方法提取率接近，提取30 min左右可达到单次提取率增加的峰值。本文选择甲醇超声提取30 min。
阿纳其根为维医治疗白癜风的常用药，因其良好的疗效而受到越来越多的关注。有关其药效物质基础的研究主要是N-烷基类成分和脂肪酸类成分的分析，而其他类成分报道则甚少，更未见阿纳其根特征成分及其含量测定的报道。本实验采用前期分离得到的2个N-烷基类成分（十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺和十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺）为指标，通过HPLC法对2个成分建立含量测定的方法，以期为阿纳其根的质量控制提供一定的依据。
含量测定结果表明，不同批次阿纳其根中十-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺和十二-2E，4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺含量有一定的差异，需结合药效进行进一步研究，制定阿纳其根真伪和优劣的标准，进一步保证临床用药的安全有效。
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