2017, Vol. 37 
柴黄颗粒由柴胡、黄芩提取物组成，具有清热消炎功效，用于上呼吸道感染、感冒发热等症状[1-2]。质量标准收载于卫生部药品标准（WS3-B-2009-95）[3]。柴胡皂苷是柴胡的主要化学成分，具有抗炎、抗病毒、抗过敏等药理活性[4]。黄芩苷是黄芩的主要有效成分之一，具有抑菌、清热、降压、镇静、利尿、利胆、抗炎、抗变态反应、解毒、抗癌等作用[5-6]。柴胡皂苷和黄芩苷的测定方法主要有HPLC法分别测定各皂苷或黄芩苷含量、分光光度法测定总皂苷或总黄酮含量[7-11]。对于柴黄颗粒的质量控制，只有采用薄层色谱法对柴胡、黄芩药材进行鉴别，采用红外光谱建立柴黄颗粒的指纹图谱[12]，采用HPLC法测定黄芩苷含量[13-14]以及分光光度法测定柴胡总皂苷含量[15]，未见柴黄颗粒中黄芩苷及柴胡皂苷含量的同时测定的文献报道。本文采用反相高效液相色谱法，对柴黄颗粒中柴胡皂苷a、b1、c、d以及黄芩苷同时进行测定，为评价和控制柴黄颗粒的质量提供了科学依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪，配置DAD检测器（Agilent公司）；Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：二异丁基-十八烷基键合硅胶）色谱柱（Agilent公司）；KQ2200B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），R-301旋转蒸发器（上海申顺生物科技有限公司），电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，d=0.01 mg），默克密理博Milli-Q超纯水机（美国默克密理博有限公司）。
1.2 试药柴胡皂苷a、b1、c、d对照品，批号141128、140621、140820、141220，含量均≥98%，成都普菲德生物技术有限公司；黄芩苷对照品，批号110715-201016，含量94.0%，中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯，水为实验室专用超纯水机制备的超纯水，磷酸、甲酸、氨水为分析纯。柴黄颗粒，批号z19993380，规格为3 g·袋-1，四川百利药业有限责任公司。
2 方法与结果 2.1 混合对照品储备液的制备精密称取对照品柴胡皂苷a 1.80 mg，柴胡皂苷b1 3.00 mg，柴胡皂苷c 4.20 mg，柴胡皂苷d 4.60 mg，黄芩苷5.00 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇约7 mL，振摇使之溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得柴胡皂苷a为0.180 mg·mL-1、柴胡皂苷b1为0.300 mg·mL-1、柴胡皂苷c为0.420 mg·mL-1、柴胡皂苷d为0.460 mg·mL-1，黄芩苷为0.500 mg·mL-1的5种对照品溶液；精密量取上述5种对照品溶液各8.0 mL，混合均匀，制成混合对照品储备液。
2.2 供试品溶液的制备称取样品细粉0.30 g，精密称定，加入5%浓氨甲醇溶液35 mL，密塞，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）30 min，过滤，用甲醇20 mL分2次洗涤容器和药渣，洗液与滤液合并，减压旋蒸，残渣加甲醇约70 mL溶解并转移至100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.3 色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.01%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0~30 min，30%A→60%A；30~35 min，60%A）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：常温（25℃）；检测波长210 nm；进样量：10 μL；运行时间：35 min。在上述色谱条件下对照品及样品的色谱图见图 1。
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1.黄芩苷（baicalin）2.柴胡皂苷c（saikosaponin c）3.柴胡皂苷a（saikosaponin a）4.柴胡皂苷b1（saikosaponin b1）5.柴胡皂苷d（saikosaponin d） 图 1 柴胡皂苷a、b1、c、d及黄芩苷对照品（A）和柴黄颗粒样品（B）的HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of saikosaponins a, b1, c and d, and baicalin(A)in Chaihuang granules(B) |
精密吸取上述混合对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别稀释定容于10 mL量瓶中，各取10 μL按上述色谱条件依次进样测定峰面积，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，柴胡皂苷a、b1、c、d及黄芩苷的回归方程、线性范围和相关系数见表 1。
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表 1 柴胡皂苷a、b1、c、d及黄芩苷的线性回归分析 Table 1 Regression analysis of saikosaponin a, saikosaponin b1, saikosaponin c, saikosaponin d and baicalin |
取供试品溶液，连续进样6次，测定峰面积。结果柴胡皂苷a、b1、d及黄芩苷峰面积的RSD分别为0.69%、0.78%、0.92%、0.77%，表明精密度良好。
2.6 稳定性试验取柴黄颗粒制成供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件分别于制备后0、2、4、6、8、10 h进样10 μL，测定柴胡皂苷a、b1、d及黄芩苷的峰面积；结果RSD分别为1.0%、1.2%、0.98%、0.97%，表明柴黄颗粒供试品溶液在10 h内稳定。
2.7 重复性试验按照“2.2”项平行制备6份柴黄颗粒供试品溶液，分别进样10 μL，结果样品中柴胡皂苷a、b1、d及黄芩苷含量平均值分别为1.562、7.574、9.221、11.648 mg·g-1，RSD分别为1.1%、0.82%、1.3%、0.99%。
2.8 回收率试验精密称取含有柴胡皂苷a 1.56 mg·g-1，柴胡皂苷b1 7.51 mg·g-1，柴胡皂苷d 9.36 mg·g-1及黄芩苷11.67 mg·g-1的柴黄颗粒样品6份，每份0.15 g，分别置于圆底烧瓶中，精密加入0.180 mg·mL-1的柴胡皂苷a对照品溶液1.0 mL和0.420 mg·mL-1的柴胡皂苷c对照品溶液1.0 mL，柴胡皂苷b1对照品1.18 mg和柴胡皂苷d对照品1.43 mg，黄芩苷对照品1.82 mg，按照“2.2”项方法进行操作，得到6份供试品溶液。分别吸取上述6份溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，进行加样回收率的考察；结果柴胡皂苷a、b1、c、d、黄芩苷平均回收率分别为97.5%、95.3%、99.7%、98.4%和95.1%，RSD分别为0.66%、0.93%、0.68%、0.74%和1.2%。
2.9 样品含量测定取3批柴黄颗粒，每批取3份，分别按照“2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，以外标法计算含量，结果见表 2。
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表 2 柴胡皂苷a、b1、c、d及黄芩苷的3批样品含量测定 Table 2 Contents of saikosaponins a, b1, c, d and baicalin in three batches of samples(mg·g-1, n=3) |
本研究考察了75%、85%、100%甲醇水溶液及5%浓氨甲醇溶液4种提取溶剂和回流提取、索氏提取、超声提取3种提取方法对提取率的影响。结果显示：5%浓氨甲醇试液超声提取时，提取效率最高；在超声时间考察时发现超声30 min以上时，提取效率基本不变，故选择超声时间为30 min。
3.2 检测波长的选择本研究考察了波长的影响。使用DAD二极管阵列检测器对5种对照品溶液在190~400 nm波长范围内进行全扫描。查看3D图谱发现：柴胡皂苷a、b1、c、d及黄芩苷在205 nm附近吸光系数均最大，但在此波长下基线漂移较大。综合考察检测灵敏度和基线漂移情况，本实验选择210 nm进行检测。
3.3 流动相的选择本研究考察了多种流动相系统。有机相分别为甲醇和乙腈，水相分别为水、磷酸水溶液（0.1%、0.05%、0.01%）、甲酸水溶液（0.1%、0.05%、0.01%）。实验结果表明，甲醇在210 nm的波长下吸收较大，基线漂移严重，所以有机相选定为乙腈。在水相中，使用甲酸水溶液为流动相时，基线明显向下漂移；使用0.1%和0.05%磷酸水溶液及0.1%和0.05%甲酸水溶液为流动相时，观察色谱图发现柴胡皂苷a、b1、c、d色谱峰均发生拖尾及分裂现象。使用水、0.01%磷酸水溶液及0.01%甲酸水溶液时色谱峰峰形好，但在以水为流动相时，黄芩苷酚羟基发生解离，使其在固定相表面有双重保留机制，峰形较差。综上所述，本实验选用乙腈-0.01%的磷酸水溶液为流动相。
3.4 小结本研究建立了同时测定柴黄颗粒中黄芩苷及柴胡皂苷a、b1、c、d的HPLC分析方法。经方法学验证，所建立的测定方法符合定量分析要求，该方法操作简单，结果准确、可靠，重现性好。可为柴黄颗粒定量控制指标的选择提供参考，为柴黄颗粒质量标准的建立提供一定的科学依据。
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