2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
枳壳来源于芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实[1]，具有理气宽中、行滞消胀的功效，主要用于治疗胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、胃下垂等证[2]，主要含有黄酮类[3]、挥发油[4]和少量生物碱等类成分。现代研究表明，枳壳提取物三氯甲烷萃取层中的多甲氧基黄酮成分川陈皮素与橘皮素，均对正常小鼠有胃肠推进作用[5]。据报道，川陈皮素还具有良好的抗炎，止血，抗癌[6]，改善记忆和影响血管平滑肌等作用，橘皮素具有抗白血病[7]和抗真菌[8]作用。另外研究表明，水合橘皮内酯为具有药理活性的成分[9]。随着对这3个化合物药理作用研究的深入，其分离纯化也越来越受到人们的关注。采用传统的分离方法分离枳壳中的水合橘皮内酯、川陈皮素和橘皮素，不仅费时费力，污染环境，而且所用固定相对样品有不可逆吸附作用。高速逆流色谱（HSCCC）是一种无固相载体的连续液-液分配色谱技术[10]，即利用溶质在2种互不相溶的溶剂系统中分配系数的不同，从而进行分离的方法。该技术可在短时间内实现复杂样品的高效分离分析，因其无固体载体，可避免分离样品与固体载体的不可逆吸附，因而样品回收率高，并且对样品的预处理要求也比较低，同时还具有应用范围广，仪器操作简单等优点，因此被广泛应用于天然产物的分离制备。本研究采用高速逆流色谱法分离制备枳壳中的水合橘皮内酯、川陈皮素和橘皮素，制备快速，制备量大，为这3个化合物对照品的快速制备提供了一种新途径，并为枳壳的质量评价提供参考。
1 仪器与试药 1.1 仪器TEB-300C高速逆流色谱仪（包括TBP5002型恒流泵、LC3000型高效液相色谱仪、CXTH-3000色谱工作站，上海同田生物技术有限公司）；99601 Dikma Diamonsil C18（2）色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm；北京迪科马科技有限公司）；Bruker AVANCE AV400超导核磁共振波谱仪（Bruker）；Agilent 6410 LC-MS-MS（Agilent）；BT224S万分之一天平（Sartoris）；DC-0506低温恒温槽（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括四元泵、在线脱气机、DAD检测器等（Agilent）。
1.2 试药乙腈为HPLC级，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。枳壳药材经江西中医药大学药用植物教研室赖学文副教授鉴定为Citrus aurantium L.的干燥未成熟果实。
2 方法与结果 2.1 样品的制备取枳壳粉末（过2号筛）500 g，用3 000 mL无水乙醇回流提取3次，趁热过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩得浸膏后用1 000 mL水分散，1 000 mL三氯甲烷萃取3次，合并萃取液，减压浓缩得浸膏后真空干燥，得粗提物5.0 g，即得样品。
2.2 样品的HPLC分析条件色谱柱：迪马Dikma Diamonsil C18（2）（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水（A）-乙腈（B），二元梯度洗脱（0~6 min，40%B；6~18 min，40%B→80%B；18~20 min，80%B→100%B；20~25 min，100%B）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：326 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。取“2.1”项下粗品适量，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，冷却，过0.45 μm有机微孔滤膜，取续滤液，在上述色谱条件下进样，色谱图见图 1。
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Ⅰ.化合物Ⅰ（compound Ⅰ）Ⅱ.化合物Ⅱ（compound Ⅱ）Ⅲ.化合物Ⅲ（compound Ⅲ） 图 1 枳壳三氯甲烷萃取部分HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatogram of chloroform crude extract from Fructus Aurantii |
在分液漏斗中按一定比例配制两相溶剂体系，充分振摇，静置分层，备用。取样品适量于玻璃试管中，加入已平衡的两相溶剂体系的下相溶液5 mL，充分振摇使样品溶解，经HPLC法检测其中目标化合物的峰面积A1，再加入两相溶剂体系的上相溶液5 mL，充分振摇，静置分层后，再用HPLC分析条件检测溶剂体系下相中目标化合物的峰面积A2，计算分配系数K（K=（A1-A2）/A2），通过分配系数K（0.5≤K≤2）选择合适的两相溶剂体系。结果表明，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（10:9:7:8）为最佳溶剂系统。K值结果见表 1。
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表 1 枳壳三氯甲烷萃取部分中3个化合物在不同两相溶剂系统的K值 Table 1 The K-values of the three compounds of chloroform crude extract from Fructus Aurantii in different two-phase solvent systems |
在2 000 mL分液漏斗中配制石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（10:9:7:8）两相溶剂体系，充分振摇，待静置分层后，上相为固定相，下相为流动相，分别取出超声（功率200 W，频率45 kHz）20 min，冷却至室温备用。取粗提物100 mg于20 mL已平衡的两相溶剂体系的下相溶液中，超声使其充分溶解，备用。
2.5 HSCCC制备分离打开温控装置，将温度设为25 ℃。以10 mL·min-1流速泵入固定相，待HSCCC分离管中充满上相后，即出口端有固定相流出时，以2 mL·min-1泵入流动相，同时开启主机，将转速调为880 r·min-1。当固定相不再从分离柱中流出时，表明已在分离柱中建立了两相间的动态平衡。此时通过进样阀口将制备好的供试品溶液注入HSCCC分离管中，在326 nm处进行检测，开始采集数据，并记录色谱图，根据色谱图吸收峰接收流份。色谱图见图 2。
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图 2 HSCCC制备分离枳壳三氯甲烷萃取部分色谱图 Figure 2 The HSCCC chromatogram of chloroform crude extract of Fructus Aurantii |
将各组分干燥，称量，化合物Ⅰ 8.8 mg，化合物Ⅱ 7.3 mg，化合物Ⅲ 4.7 mg。取化合物Ⅰ~Ⅲ适量，精密称定，分别置25 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，冷却，过0.45 μm有机微孔滤膜，取续滤液，即得，进样。对化合物Ⅰ~Ⅲ进行纯度检测，按峰面积归一化法计算其质量分数。经HPLC图谱结果表明，3个化合物峰均为单一对称尖峰，其质量分数分别为96.70%、97.89%、98.52%。色谱图见图 3。
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图 3 化合物Ⅰ~Ⅲ纯度检测HPLC图 0 Figure 3 HPLC chromatogram of purity analysis of compounds Ⅰ~Ⅲ |
分别吸取“2.6”项中配制的化合物Ⅰ~Ⅲ供试品，用甲醇稀释至约1 μg·mL-1，0.22 μm的微孔滤膜滤过后，采用液质联用技术鉴定。质谱条件：电喷雾离子源（ESI），干燥气温度为350 ℃，干燥器流速10 L·min-1，毛细管电压为4 kV，雾化器压力275.8 kPa，金属毛细管温度为300 ℃，正离子扫描模式，扫描范围为m/z 100~500。分别取“2.6”项下化合物Ⅰ~Ⅲ粉末适量，溶于CDCl3或（CD3）2CO后进行1H-NMR和13C-NMR分析。数据如下。
峰Ⅰ：ESI-MS m/z：301.10 [M+Na]+，1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 7.66（d，J=9.5 Hz，1 H），7.34（d，J=8.6 Hz，1 H），6.87（d，J=8.6 Hz，1 H），6.24（d，J=9.5 Hz，1 H），3.95（s，3 H），3.65（dd，J= 10.1，2.7 Hz，1 H），3.06（ddd，J=23.8，13.7，6.4 Hz，2 H），2.47（s，2 H），1.34（d，J=2.1 Hz，6 H）；13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 161.5（C-2），160.5（C-7），153.5（C-9），144.1（C-4），127.0（C-5），115.8（C-8），113.1（C-10），113.0（C-3），107.5（C-6），78.5（C-2′），73.2（C-3′），56.4（OCH3），26.1（C-4′），25.5（C-1′），24.2（C-5′）。以上数据与文献[11-12]一致，故鉴定化合物Ⅰ为水合橘皮内酯（meranzin hydrate）。
峰Ⅱ：ESI-MS m/z：403.19（+MS），1H NMR（400 MHz，（CD3）2CO）δ：6.626（1H，s，H-3），7.591（1H，d，J=2.4 Hz，H-2′），7.157（1H，d，J=8.8 Hz，H-5′），7.687（1H，dd，J=8.8 Hz，2 H-6′），4.08（3H，s，OCH3），4.045（3H，s，OCH3），3.967（3H，s，OCH3），3.920（3H，s，OCH3），3.896（3H，s，OCH3），3.854（3H，s，OCH3）；13C NMR（101 MHz，（CD3）2CO）δ：160.66（C-2），10 6.28（C-3），175.77（C-4），144.14（C-5），149.68（C-6），138.24（C-7），148.22（C-8），147.64（C-9），108.91（C-10），123.8（C-1′），111.62（C-2′），152.34（C-3′），151.41（C-4′），114.9（C-5′），119.38（C-6′），61.48（5-C），61.39（6-C），61.08（7-C），61.01（8-C），55.32（3′-C），55.31（4′-C）。以上数据与文献[13]一致，故鉴定化合物Ⅱ为川陈皮素（nobiletin）。
峰Ⅲ：ESI-MS m/z：373.19（+ MS），1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：6.611（1H，s，H-3），7.891（2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，H-6′），7.038（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，H-5′），4.104（3H，s，OCH3），4.024（3H，s，OCH3），3.953（6H，s，OCH3），3.891（3H，s，OCH3）；13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ：162.31（C-2），106.70（C-3），177.33（C-4），144.09（C-5），151.39（C-6），138.10（C-7），148.41（C-8），147.74（C-9），114.90（C-10），123.86（C-1′），127.73（C-2′，C-6′），114.53（C-3′，C-5′），161.20（C-4′），62.26（C-5），62.04（6-C），61.84（7-C），61.66（8-C），55.51（4′-C）。以上数据与文献[14]一致，故鉴定化合物Ⅲ为橘皮素（tangeretin）。
3 讨论 3.1 色谱条件的选择本文尝试用甲醇-水（60:40）、甲醇-水（55:45）和乙腈-水（45:55）等作为流动相进行等度洗脱，结果以乙腈-水（45:55）为流动相时分离效果较好，但分离时间比较长，后尝试采用梯度洗脱的方法，能达到分离度的要求，分离时间合适，最后确定流动相为水（A）-乙腈（B），二元梯度洗脱（0~6 min，40%B；6~18 min，40%B→80% B；18~20 min，80%B→100% B；20~25 min，100% B）。水合橘皮内酯、川陈皮素和橘皮素的对照品溶液在326 nm处均有最大紫外吸收，故选择326 nm为测定波长。
3.2 转速及流动相流速的选择预试验结果表明，流动相流速固定时，随着螺线管转速的减小，固定相的保留值会减小。流动相流速过低会导致分离周期延长，过高则会导致固定相流失且分离效果变差。故经综合考虑，转速及流动相流速分别设为880 r·min-1、2 mL·min-1。
3.3 小结HSCCC法分离制备中药对照品具有快速，成本低，制备量大等优点。本实验采用HSCCC法分离制备枳壳中的水合橘皮内酯、川陈皮素和橘皮素，快速，简便，制备量大，为这3个化合物标准品的快速制备提供了一种新途径，所得化合物纯度高，可作为枳壳药材质量控制的参考物质。
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