2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
2. 湖北科技学院药学院, 咸宁 437100
2. School of Pharmacy, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, China
中国药典2015年版定义眼用制剂是直接用于眼部发挥治疗作用的无菌制剂[1]8。眼用制剂中主药成分本身不具有充分的抗菌效力，添加适宜的抑菌剂，可防止眼用制剂在正常贮藏和使用过程中，由于微生物污染和繁殖，使药物变质而对使用者造成危害[1]151。但所有的抑菌剂都具有一定的毒性[1]151，[2-4]，眼用制剂中抑菌剂的加入量应加以控制，不可过量添加。目前，国内眼用制剂中只有少数几个滴眼液，例如硫酸新霉素滴眼液、氯霉素滴眼液、诺氟沙星滴眼液等的质量标准中对抑菌剂含量进行控制和测定。
马来酸噻吗洛尔滴眼液是β肾上腺素受体阻滞药，对原发性开角型青光眼具有良好的降低眼内压的治疗效果。对无晶体性青光眼、某些继发性青光眼、高眼压症以及其他药物及手术无效的青光眼，使用本品滴眼可进一步增强降压效果。临床也用于高血压症。
中国药典2015年版未对马来酸噻吗洛尔滴眼液中抑菌剂质量进行控制。噻吗洛尔的含量采用紫外-可见分光光度法测定。文献报道中，噻吗洛尔[6-8]和羟苯乙酯[1]569，[9-10]的含量测定分别有一定研究，但目前没有同时测定噻吗洛尔和羟苯乙酯含量的方法。本文采用HPLC法同时测定滴眼液中噻吗洛尔和羟苯乙酯的含量。
1 仪器与试药 1.1 仪器Angilent Technologies 1260高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（1260DAD）；色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×150 mm，5 μm；单官能团硅烷，具有较大的二异丁基侧链基团）；METTLER TOLEDO XS105天平，梅特勒公司METTLER AE-200电子天平；ELGA公司CLXXXUVM2纯水机；武汉嘉鹏电子有限公司JPCQ1028全数字超声波发生器。
1.2 试药对照品：马来酸噻吗洛尔，Timolol Maleate 14823：006，99.8%；羟苯乙酯，中国食品药品检定研究院，批号100847-200501。马来酸噻吗洛尔滴眼液：批号15040101、15100101、15120101、15120102，规格5 mL:25 mg（以噻吗洛尔计），武汉五景药业有限公司；批号1507113102，规格5 mL:25 mg（以噻吗洛尔计），辰欣药业股份有限公司；批号140801，规格5 mL:12.5 mg，湖北潜江制药股份有限公司；批号151002，规格5 mL:12.5 mg，湖北远大天天明制药有限公司。马来酸为化学纯，成都科龙化工试剂厂。乙腈为色谱纯，磷酸、三乙胺为分析纯。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品溶液取马来酸噻吗洛尔（以噻吗洛尔计）和羟苯乙酯对照品适量，精密称定，置量瓶中，加溶剂[乙腈-磷酸盐缓冲液（5:5）]制成每1 mL含噻吗洛尔5 mg和羟苯乙酯0.3 mg的溶液，作为混合对照品储备液；精密量取对照品储备液2 mL，置100 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含噻吗洛尔100 μg和羟苯乙酯6 μg的混合溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液精密量取马来酸噻吗洛尔滴眼液2 mL，置100 mL量瓶中（规格5 mL:25 mg）或50 mL量瓶中（规格5 mL:12.5 mg），用溶剂稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.2 色谱条件色谱柱：ZORBAX SB C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈（B）-0.1%磷酸溶液（A）（1 000 mL，加三乙胺1 mL，用氢氧化钠试液调节pH至3.9），梯度洗脱（0~5 min，78%A；5~5.2 min，78%A→55%A；5.2~10 min，55%A；10~11 min，55%A→78%A；11~13 min，78%A）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：275 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。在上述色谱条件下，样品中其他成分对噻吗洛尔和羟苯乙酯的测定无干扰。对照品、样品及溶剂色谱图见图 1（用化学纯的马来酸确定样品和对照品中马来酸峰位置）。
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1.马来酸（maleate）2.噻吗洛尔（timolol）3.羟苯乙酯（ethylparaben） 图 1 混合对照品（A）、供试品溶液（B）及空白溶剂（C）HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of mix standards(A), test solution(B)and blank solvent(C) |
精密量取“2.1.1”项下混合对照品储备液10.0、5.0、2.0、1.0、0.4、0.2、0.12 mL，分别置100 mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，制备成噻吗洛尔质量浓度分别为505.99、252.99、101.20、50.60、20.24、10.12、6.07 μg·mL-1，羟苯乙酯质量浓度分别为30.68、15.34、6.14、3.07、1.23、0.61、0.37 μg·mL-1的系列混合对照品溶液。精密吸取上述溶液20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积。以对照品质量浓度C（μg·mL-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，分别绘制标准曲线，进行线性回归。噻吗洛尔和羟苯乙酯的回归方程：
Y=8.08C+2.39 r=1.000
Y=44.59C+11.22 r=0.999 9
结果表明，噻吗洛尔和羟苯乙酯质量浓度分别在6.07~505.99和0.37~30.68 μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.3.2 精密度试验取“2.1.1”项下的混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。结果噻吗洛尔和羟苯乙酯峰面积的RSD分别为0.03%和0.7%，表明色谱系统的精密度良好。
2.3.3 稳定性试验取制备好的同一样品（批号15040101）的供试品溶液，室温放置，按“2.2”项下色谱条件，分别于制备后0、2、4、6、8、12、20 h进样20 μL进行分析，记录色谱图。结果噻吗洛尔和羟苯乙酯峰面积的RSD分别为0.9%和1.2%，表明供试品溶液中噻吗洛尔和羟苯乙酯在室温放置20 h内稳定。
2.3.4 重复性试验取同一批号马来酸噻吗洛尔滴眼液（批号15040101），分别按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，分别进样20 μL进行测定。结果样品中噻吗洛尔和羟苯乙酯的平均含量分别为103.1%、0.28 mg·mL-1，RSD分别为1.4%、1.7%，表明该方法重复性良好。
2.3.5 加样回收试验精密量取已知含量的马来酸噻吗洛尔滴眼液（批号15040101）2 mL，共9份，置200 mL量瓶中，分别以80%、100%和120% 3个水平精密加入马来酸噻吗洛尔（以噻吗洛尔计）和羟苯乙酯对照品，按照“2.1.2”项下方法制备供试溶液，按“2.2”项下色谱条件，分别进样20 μL进行测定，计算回收率，结果见表 1。噻吗洛尔和羟苯乙酯的平均回收率（n=9）为99.8%、99.8%，说明该方法准确度高。
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表 1 加样回收率试验结果 Table 1 Results of recovery test |
精密量取不同批号的马来酸噻吗洛尔滴眼液各2份，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别进样20 μL，依法测定，记录峰面积，按照外标法计算样品中噻吗洛尔和羟苯乙酯的含量，结果见表 2。
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表 2 样品中噻吗洛尔和羟苯乙酯含量测定结果 Table 2 Results of content determination of samples |
取羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯和羟苯丁酯的对照品适量，精密称定，置量瓶中，加溶剂（乙腈-磷酸盐缓冲液（5:5））制成每1 mL分别含羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯和羟苯丁酯各6 μg的混合溶液。按“2.2”项下色谱条件，进样20 μL，在上述色谱条件下，羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯和羟苯丁酯能完全分离，色谱图见图 2。
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1.羟苯甲酯（methylparaben）2.羟苯乙酯（ethylparaben）3.羟苯丙酯（propylparaben）4.羟苯丁酯（butylparaben） 图 2 羟苯酯类HPLC色谱图 Figure 2 HPLC chromatograms of paraben |
噻吗洛尔的紫外最大吸收波长为295 nm，羟苯乙酯的最大吸收波长为257 nm。取“2.1.1”项下的混合对照品溶液，用溶剂稀释，当噻吗洛尔质量浓度为0.5 μg·mL-1，羟苯乙酯质量浓度为0.03 μg·mL-1时，按“2.2”项下色谱条件，同时在257、265、275、285、295 nm的波长检测，记录色谱图。比较噻吗洛尔和羟苯乙酯的在不同波长处的信噪比，结果见表 3。由表 3结果可知，检测波长在275 nm时，噻吗洛尔和羟苯乙酯的信噪比均在10以上，可以准确定量。因此选择275 nm作为检测波长。
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表 3 样品中噻吗洛尔和羟苯乙酯信噪比结果 Table 3 Results of S/N determination of samples |
参考文献[6-11]报道的色谱条件，比较了甲醇-磷酸盐缓冲液、乙腈-磷酸盐缓冲液等度洗脱和梯度洗脱，最终确定乙腈-磷酸盐缓冲液，并优化梯度洗脱程序，结果表明，选用乙腈-磷酸盐缓冲液梯度洗脱，噻吗洛尔和羟苯乙酯的保留时间分别为3 min和8 min，出峰时间适宜，峰形好，噻吗洛尔峰峰和羟苯乙酯峰间的峰间的分离度为28，辅料无干扰。
3.3 抑菌剂的种类和用量抑菌剂的种类很多，从市场上购买到6个生产企业的10批马来酸噻吗洛尔滴眼液。药品说明书成分中标明抑菌剂种类的有：江苏远恒药业有限公司生产，抑菌剂为硫柳汞；宁夏康亚药业有限公司，抑菌剂为苯扎溴铵；其余4家企业说明书中未明确标明抑菌剂种类。经实验检测，滴眼液中抑菌剂为羟苯乙酯，但不同企业抑菌剂羟苯乙酯含量不同（见表 2）。美国FDA[12]对羟苯乙酯的含量规定最大用量为0.05%，4家企业中羟苯乙酯的含量均未超过FDA规定的最大值。文献[10]报道了15家生产企业的马来酸噻吗洛尔滴眼液中使用的抑菌剂种类和用量，除以上3种抑菌剂外，还包括醋酸苯汞。羟苯乙酯的处方量分别为0.030%、0.015%、0.050%，苯扎溴铵处方量分别为0.009 0%、0.010 0%、0.003 0%，硫柳汞处方量为0.005 0%，醋酸苯汞处方量未知。
在眼用制剂中合理使用抑菌剂及有效控制抑菌剂的质量，对保证眼用制剂安全性及有效性有重要的意义[13-14]。因此，在眼用制剂的质量标准中，应对抑菌剂的种类进行鉴别，抑菌剂的用量进行含量测定。同时，建议在眼用制剂说明书中明确标明抑菌剂的种类和用量，以便更好地指导临床用药。
本文采用HPLC法同时测定马来酸噻吗洛尔滴定液中噻吗洛尔和羟苯乙酯的含量，该方法灵敏、准确、专属性强，可作为滴眼液主药和抑菌剂的质量控制。
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