2017, Vol. 37 
2. 中国药科大学, 南京 210009
2. China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China
利伐沙班（rivaroxaban，结构如图 1），商品名Xarelto，是口服直接Xa因子抑制剂，临床用于预防和治疗静脉血栓，预防髋关节或膝关节置换手术后的静脉血栓及预防非瓣膜性房颤的静脉血栓性事件[1]。利伐沙班的合成路线见图 1[2]，其中4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮为合成利伐沙班的中心前体，与化合物2-[（2S）-2-环氧乙烷基甲基]-1H-异吲哚-1，3-（2H）-二酮和5-氯噻吩-2-碳酰氯为原料合成利伐沙班，4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮可能残留于利伐沙班形成杂质。4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮结构中含有基因毒性警示结构苯胺基团，具有潜在基因毒性[3]。欧洲药品管理局（EMEA）、美国食品药品管理局（FDA）及人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）先后颁布了基因毒性杂质控制的指导文件，推荐以毒理学关注阈值（TTC，1.5 μg·d-1）来控制用药风险[4]。基于TTC，以利伐沙班口服剂量10 mg·d-1[5]计算，4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮的限度须不超过150 μg·g-1[（1.5 μg·d-1）/（10 mg·d-1）=150 μg·g-1]。
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1.利伐沙班（rivaroxaban）2. 4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮[4-（4-aminophenyl）-3-morpholinone]3. 2-[（2S）-2-环氧乙烷基甲基]-1H-异吲哚-1，3-（2H）-二酮（2-[（2S）-2-oxiranemethyl]-1H-isoind-azole-1，3-（2H）-diketone）4. 5-氯噻吩-2-碳酰氯（5-chlorothioph-ene-2-phosgene） 图 1 利伐沙班的合成路线 Figure 1 Synthetic route of rivaroxaban |
利伐沙班尚未被各国药典收载。利伐沙班质量研究文献主要涉及含量[6-8]、有关物质或降解产物[9-11]及残留溶剂[12]的检测。沙班类基因毒性杂质文献仅见2篇，其一是关于利伐沙班中肼的测定[13]，其二是关于阿哌沙班中氯代烷基苯的测定[14]，未见利伐沙班中4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮的测定报道。本研究建立了HPLC法定量测定利伐沙班中的4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮，其中4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮限度为50 μg·g-1，足以保证利伐沙班的用药安全。本法灵敏、可靠、简便，为利伐沙班工艺过程控制和质量保障提供参考依据。
1 仪器与试药岛津公司SPD-20A高效液相色谱仪；江苏汉邦科技有限公司Habon HederaTM苯基色谱柱（苯基硅烷键合相，250 mm×4.6 mm，5 μm）。
梅特勒-托利多公司AB135-S十万分之一分析天平；德国赛多利斯公司BS110万分之一分析天平。
利伐沙班原料药（批号20130801、20130809和20130815）由江苏正大清江制药有限公司赠与。4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮对照品（含量为97%，批号LPC0M68）购自百灵威科技有限公司。利伐沙班8个杂质对照品（S）-N-[[2-氧代-3-[4-（3-氧代-4-吗啉基）苯基]-噁唑烷-5基]甲基]乙酰胺、1，3-双-[[（S）-2-氧代-3-[4-（3-氧代-4-吗啉基）苯基]-1，3-噁唑烷-5基]甲基]脲、N1，N2-双-[[（S）-2-氧代-3-[4-（3-氧代-4-吗啉基）苯基]-1，3-噁唑烷-5基]甲基]邻苯二甲酰胺、N-[[（5S）-2-氧代-3-[4-（3-氧代-4-吗啉基）苯基]-1，3-噁唑烷-5基]甲基]-噻吩-2-甲酰胺、（S）-2-[[2-氧代-3-[4-（3-氧代-4-吗啉基）苯基]噁唑烷-5基]甲基]异吲哚啉-1，3-二酮、4，5-二氯-N-[[（5S）-2-氧代-3-[4-（3-氧代-4-吗啉基）苯基]-1，3-噁唑烷-5基]甲基]噻吩-2-甲酰胺、（S）-5-氯-N-[[3-[4-[[2-（5-氯噻吩-2-基）-2-乙氧基][2-[2-（甲胺基）-2-氧代乙氧基]乙基]胺基]苯基]-2-氧代噁唑烷-5-基]甲基]噻吩-2-甲酰胺和5-氯-N-[4-[5-[（5-氯噻吩-2-甲酰胺基）甲基]-2-氧代噁唑烷-3-基]苯基]-N-[[2-（2-氧代-2-氨基）乙氧基]乙基]噻吩-2-甲酰胺（含量为98%）由江苏正大清江制药有限公司赠与。乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸二氢钠为分析纯。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：HederaTM苯基色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A相为乙腈，B相为乙腈-10 mmol·L-1磷酸二氢钠溶液（pH 3.5）（10:90），梯度洗脱（0~8 min，100%B；8~18 min，100%B→40%B；18~23 min，40%B；23~24 min，40%B→100%B；24~30 min，100%B），分析时间30 min；流速：1.2 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：242 nm；进样量：20 μL。
2.2 溶液制备 2.2.1 混合溶剂乙腈-甲醇-水（2:6:2）。
2.2.2 供试品溶液取利伐沙班原料药约20 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加混合溶剂2 mL超声（150 W，100 kHz，5 min）溶解并用相同溶剂定容，摇匀，得2 mg·mL-1的供试品溶液。
2.2.3 对照品储备液取4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮对照品约10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加混合溶剂溶解并定容，摇匀。精密量取该溶液适量，用相同溶剂稀释制成1 μg·mL-1的对照品储备液。
2.2.4 对照品溶液精密量取对照品储备液1 mL，置10 mL量瓶中，用混合溶剂稀释并定容，摇匀，得100 ng·mL-1对照品溶液（以4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮限度为50 μg·g-1和利伐沙班质量浓度为2 mg·mL-1计算，对照品溶液质量浓度为100 ng·mL-1）。
2.2.5 杂质对照品溶液取8个杂质对照品20 mg，精密称定，置同一10 mL量瓶中，加混合溶剂溶解并定容，摇匀；精密量取该溶液适量，用相同溶剂稀释制成2 μg·mL-1的杂质对照品溶液。
2.2.6 强降解产物溶液取利伐沙班原料药（批号20130801）约12.5 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加混合溶剂12 mL，超声（150 W，100 kHz，5 min）溶解，进行氧化、酸、碱、高温的加速破坏试验，得到各种破坏的强降解产物溶液。氧化破坏：加30%过氧化氢溶液1.25 mL，60 ℃水浴加热10 min，放冷至室温，用混合溶剂稀释至刻度。酸破坏：加4 mol·L-1盐酸溶液1.25 mL，60 ℃水浴加热10 min，放冷至室温，4 mol·L-1氢氧化钠溶液中和，用混合溶剂稀释至刻度。碱破坏：加0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液3.75 mL，60 ℃水浴加热10 min，放冷至室温，4 mol·L-1盐酸溶液中和，用混合溶剂稀释至刻度。高温破坏：100 ℃水浴加热30 min，放冷至室温，用混合溶剂稀释至刻度。强光破坏：取利伐沙班原料药（批号20130801）适量，于（7 000±500）lx照射12 h，取约12.5 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加混合溶剂12 mL，超声（150 W，100 kHz，5 min）溶解，放冷至室温，用混合溶剂稀释至刻度。
2.2.7 加样供试液取利伐沙班原料药（批号20130801）约20 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，精密量取对照品储备液1 mL，用混合溶剂稀释并定容，摇匀，得加样供试液[含4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮和利伐沙班分别为100 ng·mL-1和2 mg·mL-1，4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮添加水平为50 μg·g-1]。
2.3 专属性试验取“2.2”项下混合溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加样供试液、杂质对照品溶液和强降解产物溶液，分别进样，记录色谱图。4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮保留时间为6.6 min。试验发现：利伐沙班在高温和强光条件下相对稳定，未检出明显降解产物（未提供色谱图）；其他破坏条件下共检出5个降解产物（d1~d5），氧化破坏、酸破坏和碱破坏分别产生2个（d1和d2）、3个（d1、d3和d4）和2个（d3和d5）降解产物（图 2-F、G和H）。如图 2和图 3所示，空白溶剂、利伐沙班及其可能杂质和主要强降解产物均不干扰4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮的测定。
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A.混合溶剂（mixed solvent）B.4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮对照品（reference substance of 4-4-（aminophenyl）-3-morpholinone）C.利伐沙班（rivaroxaban sample）D.利伐沙班+4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮（rivaroxaban spiked with 4-4-（aminophenyl）-3-morpholinone，equivilent to 50 μg·g-1）E.杂质对照品（impurity reference substances）F.氧化降解溶液（oxidation degradation solution）G.酸降解溶液（acid degradation solution）H.碱降解溶液（alkali degradation solution） 1.利伐沙班（rivaroxaban）2. 4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮（4-（4-aminophenyl）-3-morpholinone）d1~d5.降解产物1~5（degradation product 1 to 5） 图 2 专属性试验典型色谱图 Figure 2 Typical chromatograms in specificity test |
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A~H.同图 2（same as Fig. 2） 2. 4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮（4-（4-aminophenyl）-3-morpholinone） 图 3 专属性试验色谱图同坐标比较 Figure 3 Comparison among chromatograms in the same coordinate system in specificity test |
精密量取“2.2”项下对照品储备液适量，用混合溶剂稀释制成4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮质量浓度分别为20.12、50.30、80.48、100.6、150.9和201.2 ng·mL-1的溶液，分别进样，记录色谱图。以峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，按最小二乘法进行线性回归，得回归方程：
A=40.23C+92.15 r=0.998 1
表明4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮质量浓度在20.12~201.2 ng·mL-1范围内线性关系良好。
2.5 检测限和定量限测定精密量取“2.2”项下对照品储备液适量，用混合溶剂稀释制成4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮系列浓度溶液，分别进样，记录色谱图。4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮的检测限（LOD）为10.10 ng·mL-1（信噪比=3），定量限（LOQ）为30.30 ng·mL-1（信噪比=10）。
2.6 回收率试验取利伐沙班原料药（批号20130801），按“2.2”项下制备供试品溶液，作为本底溶液。以“2.2”项下加样供试液浓度作为100%水平，取上述同批原料药，分别制备低（50%）、中（100%）、高（150%）浓度的加样供试液，每个浓度各3份，进样测定，记录色谱图；另取“2.2”项下对照品溶液，进样测定，记录色谱图；按外标法以峰面积计算回收率。在低、中、高浓度溶液中4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮回收率（n=3）分别为94.0%、99.1%和99.1%，RSD分别为1.1%、0.6%和0.9%；平均回收率（n=9）为97.4%，RSD为2.8%，表明本法准确度良好。
2.7 精密度、重复性和稳定性试验取“2.2”项下对照品溶液，连续进样6次，计算4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮峰面积的RSD（n=6）为1.7%。取“2.2”项下加样供试液6份，进样测定，按外标法以峰面积计算4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮的浓度，RSD（n=6）为2.0%。结果表明进样精密度和重复性均良好。
取“2.2”项下对照品溶液和加样供试液各1份，均分别于0、1、2、4、6、8 h时进样测定。计算2种溶液中4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮峰面积的RSD（n=6）分别为2.1%和0.9%；表明对照品溶液、加样供试液在8 h内均稳定。
2.8 样品测定取3批利伐沙班原料药，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定；另制备对照品溶液，进样测定；结果表明3批利伐沙班原料药中均未检出4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮。
3 讨论 3.1 检测方法的选择由于药物中基因毒性杂质的限度水平较低，为获得理想的灵敏度，文献多采用气相色谱-质谱法（GC-MS法）[15]、液相色谱-质谱法（LC-MS法）[14, 16-18]等联用方法进行控制，但是也面临仪器不普及、检测成本昂贵等不足。最理想的做法是，采用实验室常规方法检测基因毒性杂质，对挥发弱而紫外吸收强的杂质，首选高效液相色谱-紫外检测器法（HPLC-UV法），对挥发性强的杂质，首选气相色谱-火焰离子化检测器法（GC-FID法），这2种方法都依赖于杂质的理化性质[19]。4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮具有紫外吸收官能团苯环，本研究尝试采用HPLC-UV法进行测定。首先优化了4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮的检测波长，二极管阵列检测器（DAD）检测结果显示，4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮在波长200 nm和242 nm处有最大吸收，前者接近末端吸收干扰多，所以本研究以242 nm为检测波长。在242 nm波长处4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮对照品溶液的LOQ约为30 ng·mL-1。所建立方法要满足杂质限度要求（50 μg·g-1），需要尽量增加利伐沙班的溶解度。利伐沙班在水中溶解度较差，在乙腈中溶解度较好，但是采用过高的乙腈比例会出现溶剂效应，导致4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮的峰形前延，影响灵敏度。综合考虑采用了乙腈-甲醇-水（2:6:2）作为溶样溶剂，在该溶剂中利伐沙班溶解度为2 mg·mL-1，能满足利伐沙班的溶解度要求。
3.2 色谱条件的选择应用最广的反相液相色谱法固定相是十八烷基硅烷键合相（C18），其次就是苯基硅烷键合相[20]。苯胺类物质的峰形受到色谱柱填料的影响，本研究对比了Hedera填料的不同官能团柱，结果发现苯基硅烷键合柱对4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮的分离度有明显改善作用。推测原因为，苯基固定相与不饱和分析物间存在特殊的π-π作用，较之于常见的C18填料，对该类物质选择性高[20-22]，对其分离度和出峰顺序影响较大。
流动相有机相比例选择的主要目的是将4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮与利伐沙班及其杂质、降解产物分离开来，即确保专属性。文献报道，不同比例的乙腈会影响苯基柱π-π作用强度[22]，除π-π作用外，苯基硅烷键合相的分离机制，还存在疏水作用和氢键作用[20, 22]。本研究通过梯度洗脱改变有机相中乙腈比例而影响分离机制，从而改善分离度；同时，通过调节流动相pH，使苯胺类杂质带电荷而减少保留，进一步加大分离度。结果显示，本研究利用待测物间的不饱和和极性差异，发挥苯基柱的独特优势，对4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮与利伐沙班及其杂质、降解产物进行了良好分离。
3.3 结论本方法能够对利伐沙班中的苯胺类基因毒性杂质4 -（4 -氨基苯基）-3-吗啉酮进行有效监控，专属性强，灵敏度高，满足基因毒性杂质测定的特殊要求，可作为利伐沙班杂质的质控方法。
| [1] |
BARDY G, FISCHER F, APPERT A, et al. Is anti-factor Xa chromogenic assay for rivaroxaban appropriate in clinical practice? Advantages and comparative drawbacks[J]. Thromb Res, 2015, 136(5): 396. |
| [2] |
拜耳医药保健股份公司. 制备4-(4-氨基苯基)-3-吗啉酮的方法: 中国, 200480026537. X[P]. 2006-10-25 Bayer Healthcare AG.A Preparation Method for 4-4-(aminophenyl)-3-morpholinone:China, 200480026537.X[P].2006-10-25 |
| [3] |
MÜller L, Mauthe RJ, Riley CM, et al. A rationale for determining, testing, and controlling specific impurities in pharmaceuticals that possess potential for genotoxicity[J]. Regul Toxicol Pharmacol, 2006, 44(1): 198. |
| [4] |
Szekely G, AMORES de SOUSA MC, Gil M, et al. Genotoxic impurities in pharmaceutical manufacturing:sources, regulations, and mitigation[J]. Chem Rev, 2015, 115(8): 8182. |
| [5] |
FDA.Full Prescribing Information[EB/OL].[2013-10-12] http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2011/022406s000lbl.pdf
|
| [6] |
张倩如, 张琪, 郭小丰, 等. HPLC法测定利伐沙班中对映异构体的含量[J]. 中国药师, 2014, 17(10): 1629. ZHANG QR, ZHANG Q, GUO XF, et al. Determination of enantiomer in rivaroxaban by HPLC[J]. China Pharm, 2014, 17(10): 1629. DOI:10.3969/j.issn.1008-049X.2014.10.006 |
| [7] |
袁利杰, 刘辉, 杨本霞, 等. HPLC法测定利伐沙班片的含量和有关物质[J]. 药物分析杂志, 2015, 35(4): 699. YUAN LJ, LIU H, YANG BX, et al. Determination of content and related substances of rivaroxaban tablets by HPLC[J]. Chin J Pharm Anal, 2015, 35(4): 699. |
| [8] |
崔萍, 纪安成, 张爱华, 等. 利伐沙班及其光学异构体的HPLC法分离与测定[J]. 中国医药工业杂志, 2015, 46(11): 1220. CUI P, JI AC, ZHANG AH, et al. Chiral separation and determination of rivaroxaban and its isomer by HPLC[J]. Chin J Pharm, 2015, 46(11): 1220. |
| [9] |
石宛平, 汪涓, 何乐, 等. HPLC法测定利伐沙班有关物质)[J]. 沈阳药科大学学报, 2015, 32(8): 627. SHI WP, WANG J, HE L, et al. Determination of rivaroxaban related substances by HPLC[J]. J Shenyang Pharm Univ, 2015, 32(8): 627. |
| [10] |
刘超逸, 张戈, 杭太俊, 等. HPLC法鉴定利伐沙班有关物质[J]. 中国药科大学报, 2015, 46(4): 450. LIU CY, ZHANG G, HANG TJ, et al. Identification of related substances in rivaroxaban by LC-MS[J]. J China Pharm Univ, 2015, 46(4): 450. |
| [11] |
Rao PSP, Cholleti VK, Reddy VR. Stability-indicating UPLC method for determining related substances and degradants in rivaroxaban[J]. Int J Res Pharm Sci, 2015, 5(2): 17. |
| [12] |
王雪萍, 崔锋, 郑台. 采用新型混合模式液相色谱测定利伐沙班中的残留溶剂乙酸[J]. 中国医药工业杂志, 2015, 46(6): 623. WANG XP, CUI F, ZHENG T. Determination of residual acetic acid in rivaroxaban by HPLC with the new mixed-mode column[J]. Chin J Pharm, 2015, 46(6): 623. |
| [13] |
张萌萌, 倪翔, 陈梦柯, 等. 利伐沙班中肼的柱前衍生化-HPLC法测定[J]. 中国医药工业杂志, 2015, 46(11): 1223. ZHANG MM, NI X, CHEN MK, et al. Determination of hydrazine in rivaroxaban by pre-column derivatization-HPLC[J]. Chin J Pharm, 2015, 46(11): 1223. |
| [14] |
王慧君, 潘红娟, 刘超, 等. 阿哌沙班中基因毒性杂质的LC-MS法测定[J]. 中国医药工业杂志, 2015, 46(9): 1004. WANG HJ, PAN HJ, LIU C, et al. Determination of the genotoxic impurity in apixaban by LC-MS[J]. Chin J Pharm, 2015, 46(9): 1004. |
| [15] |
Wollein U, Schramek N. Simultaneous determination of alkyl mesilates and alkyl besilates in finished drug products by direct injection GC/MS[J]. Eur J Pharm Sci, 2012, 45(11): 201. |
| [16] |
刘俊华, 钟雅妮, 熊渊, 等. LC-MS测定甲磺酸伊马替尼中基因毒性杂质的含量[J]. 药物分析杂志, 2013, 33(7): 1168. LIU JH, ZHONG YN, XIONG Y, et al. LC-MS determination of genotoxic impurities in imatinib mesylate[J]. Chin J Pharm Anal, 2013, 33(7): 1168. |
| [17] |
Guo T, Shi YY, Zheng L, et al. Rapid and simultaneous determination of sulfonate ester genotoxic impurities in drug substance by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry:Comparison of different ionization modes[J]. J Chromatogr A, 2014, 1355(7): 73. |
| [18] |
Huang zy, Francis r, Zha y, et al. Development of a simple method for quantitation of methanesulfonic acid at low ppm level using hydrophilic interaction chromatography coupled with ESI-MS[J]. J Pharm Biomed Anal, 2015, 102(8): 17. |
| [19] |
Liu DQ, Sun MJ, Kord AS. Recent advances in trace analysis of pharmaceutical genotoxic impurities[J]. J Pharm Biomed Anal, 2010, 51(11): 999. |
| [20] |
Euerby MR, Petersson P, Campbell W, et al. Chromatographic classification and comparison of commercially available reversed-phase liquid chromatographic columns containing phenyl moieties using principal component analysis[J]. J Chromatogr A, 2007, 1154(4): 138. |
| [21] |
Goss JD. Improved liquid chromatography of salicylic acid and some related compounds on a phenyl column[J]. J Chromatogr A, 1998, 828: 267. DOI:10.1016/S0021-9673(98)00655-4 |
| [22] |
Yang M, Fazio S, Munch D, et al. Impact of methanol and acetonitrile on separations based on π-π interactions with a reversed-phase phenyl column[J]. J Chromatogr A, 2005, 1097(1-2): 124. DOI:10.1016/j.chroma.2005.08.028 |