亚热带农业研究 2021,Vol. 17Issue (1): 16-21   PDF   
DOI: 10.13321/j.cnki.subtrop.agric.res.2021.01.004
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文章信息

周建金, 叶炜, 邓才生, 施小梅, 黄伟群, 华树妹
ZHOU Jianjin, YE Wei, DENG Caisheng, SHI Xiaomei, HUANG Weiqun, HUA Shumei
混倍体参薯再生植株的倍性与性状分析
Analysis of ploidy and phenotypic traits of regenerated plants of mixoploids in Dioscorea alata Linn.
亚热带农业研究, 2021, 17(1): 16-21
Subtropical Agriculture Research, 2021, 17(1): 16-21.
DOI: 10.13321/j.cnki.subtrop.agric.res.2021.01.004

文章历史

收稿日期: 2021-01-25
混倍体参薯再生植株的倍性与性状分析
周建金1, 叶炜1, 邓才生1, 施小梅1, 黄伟群2, 华树妹1     
1. 三明市农业科学研究院,福建 沙县 365500;
2. 福建省种子总站,福建 福州 350000
摘要[目的] 通过组织培养,使四倍体和六倍体的混倍体参薯再生植株倍性和性状产生分离,以期获得倍性和性状均稳定的株系。[方法] 采用组织培养获得再生植株;通过染色体制片方法鉴定其倍性;再通过田间繁殖,鉴定再生植株染色体倍性和性状的稳定性。[结果] (1) 2, 4-D是诱导参薯愈伤组织形成的关键因子,愈伤组织诱导率达51.67%;椰子汁能有效促进愈伤组织的生长发育,分化率达46.67%。(2)混倍体参薯经组织培养后,再生植株出现了性状和倍性的分离。再生植株四倍体、六倍体和混倍体的获得率分别为28.33%、20.00%和56.67%。(3)单一倍性的再生植株经繁殖后,子代之间的生物学性状和染色体数目稳定一致。不同再生植株的染色体倍性和生物学性状有所差异。[结论] 利用组织培养分离纯化混倍体,是创建稳定植株和种质资源的有效方法。通过组织培养,从混倍体参薯中分离出多组生物学性状稳定的四倍体或六倍体株系,为参薯品种选育提供了新种质。
关键词混倍体参薯    组织培养    倍性鉴定    生物学性状    
Analysis of ploidy and phenotypic traits of regenerated plants of mixoploids in Dioscorea alata Linn.
ZHOU Jianjin1, YE Wei1, DENG Caisheng1, SHI Xiaomei1, HUANG Weiqun2, HUA Shumei1     
1. Institute of Agricultural Sciences of Sanming City, Shaxian, Fujian 365500, China;
2. Fujian General Station of Seeds, Fuzhou, Fujian 350000, China
Abstract: [Purpose] Through tissue culture, the tetraploid, hexaploid, and mixoploids in Dioscorea alata Linn. of regenerated plants were separated in order to obtain lines with stable ploidy and phenotypic trait. [Method] Tissue culture was used to obtain regenerated plants, the ploidy of the regenerated plants was identified by chromosome preparation method, and then the ploidy and trait stability of the regenerated plants were identified through field propagation. [Result] (1) 2, 4-D was the key factor for inducing callus formation of D.alata. The callus induction rate was up to 51.67%. Coconut juice could effectively promote the growth and development of callus, with differentiation rate of up to 46.67%. (2) After tissue culture of mixoploids in D.alata, the regenerated plants separated for traits and ploidy. The acquisition rates of tetraploid, hexaploid and mixoploids in regenerated plants were 28.33%, 20.00%, and 56.67%, respectively. (3) Once the ploidy stable regenerated plants were reproduced and cultivated, their offspring showed stable and consistent biological characteristics and chromosome number. The chromosome ploidy and biological characteristics of different regenerated plants were different. [Conclusion] Using tissue culture to separate and purify mixoploids was an effective method to create stable plants and germplasm resources. Through tissue culture, this study isolated multiple sets of tetraploid or hexaploid strains with stable biological characteristics from D.alata, which provided new germplasm for the selection and breeding of D.alata.
Key words: mixoploids in Dioscorea alata Linn.    tissue culture    ploidy identification    biological characteristics    

参薯(Dioscorea alata Linn.)又名大薯,系薯蓣科薯蓣属多年生藤质草本植物,主产于浙江、广东、广西、湖南、湖北、福建、四川、江西等省,其块茎富含淀粉和粗蛋白,可作粮食和蔬菜食用,也可制取淀粉[1-2]。此外,参薯还是药用植物,具有健脾养胃、生津益肺、补肾益精和益脑养颜的功效,常用于抗衰老与治疗糖尿病、心血管疾病和消化不良等[3]

在福建省,参薯主要用于菜肴和制作特色小吃,种植历史悠久,发展前景广阔[4]。三明市农科院淮山课题组对福建栽培的参薯进行倍性鉴定发现, 部分参薯是混倍体。田间种植此混倍体时,植株叶片、藤蔓和地下块茎颜色等生物学性状极不稳定。通过多次种植提纯,仍无法得到性状稳定的株系,致使混倍体参薯难以在育种中使用。Huang et al[5]通过组织培养,将混倍体盾叶薯蓣的叶片诱导愈伤组织并形成芽,获得二倍体、混合倍体和四倍体再生植株。目前,通过组织培养,已从混倍体膜荚黄芪[6]、混倍体紫松果菊[7]和混倍体胡杨[8]中纯化出二、三、四、六或八倍体再生植株。因此,本研究采用组织培养,以四倍体和六倍体的混倍体参薯茎段为外植体,对再生植株进行倍性鉴定和性状观测,以期获得单一倍性、性状稳定的植株,为丰富参薯种质资源开辟新途径。

1 材料与方法 1.1 供试材料

混倍体参薯材料采自龙岩市上杭县。组织培养和染色体观察所用生化试剂均购自西陇化工股份有限公司。

1.2 组织培养 1.2.1 茎段消毒和愈伤组织诱导

6月中旬将同一株的混倍体参薯茎蔓剪成1 cm左右的带腋芽茎段,用自来水冲洗干净,装入瓶中,流水冲洗1~2 h。材料晾干后在超净工作台上用体积分数为75%的酒精浸泡15 s,无菌水冲洗2~4次再投入质量分数为0.1%的升汞中,持续摇晃8~10 min后取出,用无菌水冲洗5~8次。消毒后分别接种至①~④号诱导愈伤培养基。①号:1/2MS+0.5 mg·L-1 2, 4-D+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA+70 mL·L-1椰子汁;②号:1/2MS+0.5 mg·L-1 2, 4-D+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA;③号:1/2MS+0.5 mg·L-1 2, 4-D+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 KT;④号:1/2MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 KT。每个处理20个茎段,一瓶接种茎段5根,3次重复,45 d后统计愈伤组织诱导率和质量。$诱导率/\% = \frac{{产生愈伤组织的茎段数}}{{接入的茎段数}}*100$

1.2.2 分化培养

将诱导好的愈伤组织(不切割)转接到分化培养基:1/2MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA。45 d后统计愈伤组织的分化率。$分化率/\% = \frac{{分化出小苗的愈伤组织数}}{{接入的愈伤组织数}}*100$

1.2.3 生根壮苗

待愈伤组培分化的芽苗(未进行再增殖培养)长至3 cm高时,直接切下小苗接入生根培养基:1/2MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA+0.5 g·L-1 AC。

以上组织培养所涉及的培养基均加入20 g·L-1蔗糖、5 g·L-1琼脂,pH值5.8;培养环境的温度为(25±2) ℃,光照强度1 500-2 000 lx,光照时间为12 h·d-1

1.3 根尖染色体数鉴定

选取有3条以上根的小苗,自来水冲去琼脂,取其根尖进行染色体观察,统计倍体获得率,20株为一重复,3次重复。根尖染色体制片参照周建金等[9]的方法。选取染色体分散好的细胞拍照和计数。计数时,每个根尖至少统计20个细胞,取85%以上具有恒定、一致的染色体数作为该植株的染色体数。

1.4 生物学性状与染色体倍性稳定性的鉴定

将单一倍性的组培苗栽种到基质(泥炭土∶砂子=2∶1)中,每隔7 d施用1次营养液,驯化3个月后移栽大田种植。在再生植株中选取倍性稳定、生物学性状差异明显的3个单株,将单株进行连续切块种植,繁殖后代分别编号为1、2、3号株系。每个株系分成60块,每重复20块,3次重复,以混倍体参薯为对照。观察或测定供试材料的生物学性状和根尖染色体倍数,分析子代的生物学性状和染色体数目的稳定性。重点观测特异的生物学性状,包括:叶形、叶色、叶脉颜色、叶柄两端颜色、叶长、叶宽、薯皮颜色和薯肉颜色。植株地上部分的观察记录时间为2018年6月,地下块茎的考察与记录时间为2018年10月。

2 结果与分析 2.1 培养基配方对参薯愈伤组织生长诱导的影响

表 1可见,添加2, 4-D的①、②、③号培养基均诱导出愈伤组织,且①、②、③号培养基的愈伤组织诱导率差异不显著,愈伤组织诱导率最高达51.67%。添加KT而未添加2, 4-D的④号培养基,未能诱导出愈伤组织,说明KT对愈伤组织诱导没有显著影响,2, 4-D对诱导出愈伤组织起关键作用。①号培养基比②、③号培养基多添加了椰子汁,其愈伤组织质量和分化率显著高于②、③号培养基,分别达6.06 g和46.67%,说明椰子汁能有效促进愈伤组织的生长发育。③号培养基比②号多添加了KT,两者的愈伤组织质量和分化率差异不明显,说明KT对愈伤组织质量和分化率没有显著影响。

表 1 诱导培养基对参薯愈伤组织诱导的影响1) Table 1 Effecs of induction medium on callus induction of D.alata
培养基 诱导率/% 愈伤组织总重/g 分化率/%
①号:1/2MS+0.5 mg·L-1 2, 4-D+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA+70 mL·L-1椰子汁 50.00±5.00a 6.06±0.19a 46.67±5.77a
②号:1/2MS+0.5 mg·L-1 2, 4-D+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA 51.67±10.41a 3.72±0.38b 30.00±10.00b
③号:1/2MS+0.5 mg·L-1 2, 4-D+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 KT 48.33±10.41a 3.78±0.21b 26.67±5.77b
④号:1/2MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 KT 0 - -
1)同列数值后附不同小写字母者表示差异达0.05显著水平。
2.2 再生植株性状与倍性分离 2.2.1 性状分离

图 1A中,外植体经诱导产生了愈伤组织,愈伤组织经分化后产生了不同颜色叶片的芽苗;图 1B~1D中,芽苗经生根和驯化后产生了差异明显的外观性状;图 1B为生根45 d的再生植株,其叶片、茎秆和根部薯块的颜色差异明显;图 1C1D均为驯化3个月的组培苗,再生植株的新叶有紫色、淡紫色和绿色。以上说明,组培后混倍体参薯再生植株性状出现了分离。

A.愈伤组织;B.再生植株生根;C、D.驯化3个月的再生植株。 图 1 混倍体参薯再生植株的性状分离 Figure 1 Traits separation among regenerated plants from mixoploids in D.alata
2.2.2 倍性分离

四倍体和六倍体的混倍体参薯愈伤组织分化芽苗经生根后,通过根尖染色体数鉴定,再生植株中检测到3种不同的倍性水平(四倍体、六倍体以及四倍体和六倍体的混倍体)。从表 2可见,再生植株中混倍体的获得率最高,占56.67%;四倍体次之,占28.33%;六倍体获得率最低,占20.00%。

表 2 混倍体参薯组培再生植株的倍性分离 Table 2 Ploidy separation among regenerated plants from mixoploids in D.alata
再生植株 株数 倍性获得率/%
四倍体 六倍体 混倍体
重复1 20 20.00 25.00 55.00
重复2 20 40.00 20.00 40.00
重复3 20 25.00 15.00 60.00
平均 20 28.33 20.00 56.67
2.3 再生植株倍性与生物学性状稳定性分析 2.3.1 倍性稳定性

表 3图 2可见,1号(图 2B)、2号(图 2C)株系染色体均为40条,3号(图 2D)再生植株染色体为60条。3个单株经过反复切块繁殖后,其染色体数目、倍性均稳定一致,而混倍体参薯经过多次的切块繁殖后仍是混倍体。以上表明,组织培养后混倍体参薯不仅能获得倍性不同的再生植株,还能获得倍性稳定性良好的繁殖后代。

表 3 混倍体参薯再生植株的生物学性状和倍性1) Table 3 Biological characteristics and ploidy of regenerated plants from mixoploids in D.alata
株系 再生植株染色体数 扩繁后染色体数 叶片颜色 叶脉颜色 叶形 叶柄两端颜色 叶长宽比 薯肉颜色
1号 重复1 2n=4x=40 2n=4x=40 黄绿色 淡紫色 长三角心形 紫色 1.71±0.11a 白紫相间
重复2 2n=4x=40 2n=4x=40 黄绿色 淡紫色 长三角心形 紫色 1.74±0.28a 白紫相间
重复3 2n=4x=40 2n=4x=40 黄绿色 淡紫色 长三角心形 紫色 1.81±0.33a 白紫相间
2号 重复1 2n=4x=40 2n=4x=40 黄绿色 淡紫色 长三角心形 紫色 1.85±0.23a 紫色
重复2 2n=4x=40 2n=4x=40 黄绿色 淡紫色 长三角心形 紫色 1.71±0.32a 紫色
重复3 2n=4x=40 2n=4x=40 黄绿色 淡紫色 长三角心形 紫色 1.90±0.26a 紫色
3号 重复1 2n=6x=60 2n=6x=60 绿色 绿色 正三角心形 淡紫色 1.04±0.12b 白色
重复2 2n=6x=60 2n=6x=60 绿色 绿色 正三角心形 淡紫色 1.15±0.23b 白色
重复3 2n=6x=60 2n=6x=60 绿色 绿色 正三角心形 淡紫色 1.12±0.19b 白色
CK 重复1 2n=4x, 6x=40, 60 2n=4x, 6x=40, 60 黄绿色 淡紫色 长三角心形 紫色 1.75±0.11a 白紫相间
重复2 2n=4x, 6x=40, 60 2n=4x, 6x=40, 60 黄绿色 淡紫色 长三角心形 紫色 1.95±0.21a 白紫相间
重复3 2n=4x, 6x=40, 60 2n=4x, 6x=40, 60 黄绿色 淡紫色 长三角心形 紫色 1.75±0.23a 白紫相间
1)同列数值后附不同小写字母者表示差异达0.05显著水平。
A.混倍体参薯(2n=4x=40, 2n=6x=60);B.1号株系再生植株(2n=4x=40);C.2号株系再生植株(2n=4x=40);D.3号株系再生植株(2n=6x=60)。 图 2 混倍体参薯与3组再生植株的染色体 Figure 2 Chromosomes of mixoploids in D.alata and three groups of regenerated plants
2.3.2 生物学性状稳定性

表 3图 3可见,选取的3个再生单株经切块繁殖后,相同株系的质量性状均稳定一致,数量性状差异不显著。以上说明,组培后单一倍性的混倍体参薯再生植株后代生物学性状稳定性良好。但不同株系之间生物学性状差异明显,如1号(图 3B3F)、2号(图 3C3G)、3号(图 3D3H)再生植株,薯肉的颜色均与对照(图 2A2E)不同;3号(图 3D3H)再生植株的生物学性状几乎不同于对照(图 3A3E), 表现为叶片、叶脉颜色变成了绿色,叶形变成正三角心形、叶柄变成淡紫色,叶长和叶宽与对照、1号和2号再生植株差异显著。

A为对照的地上部分;B~D分别为1号、2号、3号株系的地上部分;E为对照的薯块;F~H分别为1号、2号、3号株系的薯块。 图 3 混倍体参薯与3组再生植株的地上部分和薯块 Figure 3 Above-ground parts and potato pieces of mixoploids in D.alata and three groups of regenerated plants

综上所述,通过对混倍体参薯进行组织培养,不仅能获得倍性和生物学性状稳定的再生植株,还能获得染色体倍性和生物学性状不同的再生植株。

3 讨论

黄涛等[10]对黄姜(薯蓣科薯蓣属植物)种内染色体数目研究表明,黄姜个体内存在混倍体现象,可能通过细胞内有丝分裂形成了混倍体现象,阐明了黄姜多倍体起源的一种可能途径。此混倍体现象在黄山药[11]、圆山药[12]中也有报道。本研究亦发现福建参薯个体内存在四倍体和六倍体的混倍体。综上表明,混倍体现象在薯蓣科薯蓣属植物中常有发生,而混倍体植物自然发生为多倍体育种带来新的前景。

本研究通过对四倍体和六倍体的混倍体参薯进行组织培养,获得了四倍体、混倍体和六倍体的再生植株,再对再生植株进行田间种植,不仅获得了生物学性状稳定、染色体倍性单一的株系,还获得了生物学性状和倍性不同的多组株系,丰富了参薯的种质资源。这与前人的研究结果相一致[5-8]。因此,利用组织培养分离纯化混倍体,是创建稳定植株和种质资源的有效方法。

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