杉木[Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook.]种子败育通常有两种类型。一类为瘪粒，表现为成熟种子小而薄，种胚干瘪萎缩成极小的褐点，重量轻，易辨认，在净种环节容易剔除；另一类称为涩籽或涩粒，其大小、重量、色泽等外观形态与健籽相差无几，不易用简单的方法去除^[1]，但剖开种皮后则可观察到暗红褐色的败育种子。现有杉木种子园涩籽的比率较高，平均在30%以上^[2-4]。郑新华^[5]研究表明，在福建省尤溪国有林场三代种子园中，无性系涩籽率最高达89%。由于涩籽难分辨、高发生，不仅影响杉木种子园良种产量与品质，也增加了杉木育苗成本。

自20世纪60年代起，国内许多学者针对杉木涩籽问题展开了大量研究，主要包括解剖学分析、内含物成分鉴定、生理生化变化以及产生涩籽的生态影响因子等方面。当前，杉木涩籽的分子机理研究为进一步阐明发生机制提供了分子依据。本文对杉木涩籽形成的影响因素、形态结构特征、涩籽物质组分、生理生化变化以及分子生物学研究等5个方面进行综述，提出了深入开展涩籽形成机理研究和改进杉木高世代种子园营建策略的建议，以期为涩籽性状改良和良种质量提升提供参考。

1 涩籽形成的影响因素

造成杉木涩籽的原因十分复杂，管康林^[2]将其归纳为遗传性、自交不育、不良气候因素以及生理生化差异等4个方面。从已有研究来看，涩籽形成受遗传因素与环境因素的共同影响。

1.1 遗传因素

杉木涩籽的形成可能与特定基因型有关。同个杉木种子园中不同家系或无性系的涩籽率有显著的差异。广西融水贝江河林场1.5代杉木种子园中27个无性系涩籽率的变异系数为23.71%，无性系间差异达到极显著水平^[4]；浙江遂昌杉木种子园中20个无性系涩籽率变动幅度在14.7%~54.2%之间，无性系间方差达极显著水平^[6]；浙江横畈林场1.5代杉木种子园中16个无性系涩籽率的变动幅度在14.7%~31.8%之间^[7]。这表明杉木涩籽率性状与遗传背景之间存在一定的相关性，可能受到特殊基因型的调控。另外，何福基^[8]报道了一些家系的涩籽率不受环境变化的影响，不同年份的变动系数不大。这表明某些基因型对涩籽的影响程度要大于环境因素，可能起到决定性作用。这些基因型出现近交、自交等高度纯合时，将导致涩籽率的大幅上升。王润辉等^[9]认为，杉木雌雄花花期存在重叠，加之种子园管理上往往采用截干矮化管理而缩短了雌雄花的空间间隔，导致自花授粉比率较高，进而诱发涩籽的大量出现。而人工辅助授粉工作可有效降低涩籽率^[10], 其机理可能是胚胎致死基因座位上的等位基因纯化。

上述报道表明涩籽受遗传因素的影响，但关于涩籽性状的基因分型及数量性状座位(quantitative trait locus, QTL)定位研究尚未见报道。在将来的研究中可选择各种子园筛选的不同涩籽率表型无性系开展定向杂交授粉工作，以杉木基因组数据为基础，结合全基因组关联分析、群体转录组测序与分析等技术手段，筛选与涩籽高度相关的分子标记位点，并进一步开展基因分型工作，从而更准确地揭示影响涩籽的遗传因素。

1.2 环境因素

外部气候条件也可影响杉木涩籽的发生^[11-12]。林思祖等^[13]应用逐步回归法分析了47个影响杉木涩籽发生的气象因素，认为涩籽发生与不同生长时期的降雨量、相对湿度、最高气温、蒸发量等有较强的相关性，如3月的降雨量与涩籽率呈显著正相关，而8—9月的最高气温则与其呈显著负相关。产区地理位置不同，杉木涩籽率也有明显差异^[14]，如福建省的一般产区通常较中心产区高7.9%左右，变动系数也更大^[15]；闽东南地区还存在极为明显的高涩籽率趋势面^[16]。涩籽的发生还可能受到局部小气候的影响。下部枝条着生的球果涩籽发生率明显高于中上部，可能是由于不同冠层球果受到局部光照、空气流通程度、花粉扩散空间等微环境因素的差异造成涩籽率的不同^{[6, 17]}。另外，陈晓阳等^[18]提出杉木球果的形态与涩籽发生具有相关性，紧包半圆型、反卷型、松张宽鳞型和松张半圆型珠鳞的涩籽率较高。可见，种鳞开放程度越高，则越容易受到外界环境因素的影响，而出现涩籽现象。

综上可见，杉木涩籽形成受环境因素影响。由于当前未见有关降水、温度、蒸发量以及土壤养分等因素的控制试验的报道，因此环境因素是直接产生环境信号而诱导相应基因的表达，还是通过影响花粉扩散行为而产生作用，目前尚不知晓。

2 涩籽的形态结构

形态结构学上的差异是揭示杉木败育形成机制的表型证据，不同杉木败育类型具有不同的形态结构特征。吕洪飞等^[19-21]通过形态学和细胞学技术手段，分析了杉木雄性不育型败育小孢子的形态变化，发现其主要发生在孢原细胞到四分体时期，而输导组织发育异常、小孢子囊壁中层细胞增生、绒粘层过早解体及囊外包被结构可能是导致杉木小孢子发育异常的主要原因。

涩籽与健籽种胚形态结构存在较大差异。杉木存在受精延迟现象，授粉完成后，小孢子会停留在珠孔附近长达1个月左右，期间虽然萌发出花粉管，但并不形成颈卵器，而大孢子则继续发育直至成熟^[22]。这一阶段涩籽还未表现出败育现象。5月杉木雌配子体发育期是涩籽胚胎败育的起始阶段，此时涩籽胚珠瘦小，珠孔和珠心组织萎缩，花粉管提前延伸至尚未发育完全的胚珠内部^[23]。6月中上旬，健籽在近珠孔端形成颈卵器，并开始正常受精；但涩籽的珠心组织仍未发育完全，不能为雌配子体的正常发育提供充足的营养，造成雌配子体发育不健全，同时胚珠严重萎缩，不具备完整的细胞结构，无法正常受精。此时可以观察到在珠孔端有涩籽物质出现，并随着涩籽的发育而逐渐向种子下部积累^[24]。因此，可以将杉木涩籽的形成总结为胚胎的败育和涩籽物质积累两个过程，它们发生的时间与空间不同。

上述研究仅从显微观测中获得推论，并不能解释涩籽物质的积累与种胚败育之间的关系。究竟是种胚败育造成组织细胞破损而产生应激信号，进而导致涩籽物质的积累，还是在胚胎发育初期，涩籽物质积累存在“微量高效，逐级放大”的效应从而诱发种胚败育，无法通过显微观测法判别，还需要综合更多的证据。

3 涩籽物质的组成成分 3.1 涩籽物质定性

杉木涩籽物质指种腔中的暗红褐色物质。早期研究认为杉木涩籽中存在单宁类物质，占种子总重量的20%~30%^{[10, 25]}，是涩籽物质的主要成分。沈永宝等^[26]认为，部分空瘪粒在种眼基部可观测到积累了少量单宁类物质，也应划分为涩籽。可见，单宁类物质是杉木涩籽的标志性代谢物。林小琴等^[27]认为，涩籽物质包括类黄酮类—多酚类化合物，涵盖了所有单宁和单宁类衍生物，并以改良的超声波提取法测定了涩籽与健籽中的多酚类物质，发现其占比分别为38.3%、18.4%。Chen et al^[28]分析了涩籽物质积累期的代谢特征，证实类黄酮类代谢物在涩籽中呈极显著上调积累，占差异代谢物总数的55.4%。可见，类黄酮类—多酚类化合物是涩籽物质的主要成分。

3.2 涩籽物质组分

余象煜等^[29]最早测定了涩籽物质的具体组分。林小琴^[30]利用高效液相色谱—质谱联用(LC-MS)技术对成熟涩籽和健籽进行了成分鉴定，共发现有83种差异代谢物。其中，没食子酸、儿茶素、领苯二酚、阿魏酸等9种多酚类代谢物在涩籽中的含量远高于健籽。陈宇^[31]分析了涩籽物质积累期的代谢物含量动态变化，筛选出144种类黄酮类代谢物，在涩籽物质积累期的不同阶段类黄酮类代谢物含量变化也有所差异。说明类黄酮类—多酚类化合物在涩籽物质积累过程中处于动态变化状态。

类黄酮类—多酚类化合物具有较强的活性氧(ROS)结合能力，在细胞抗氧化体系中起重要作用^[32-33]。类黄酮类—多酚类化合物的过量积累表明涩籽组织细胞可能受到ROS的攻击，这与显微证据相符合。类黄酮类—多酚类化合物可以通过多种方式对种子发育产生影响。过量积累的多酚类化合物可造成荔枝种胚内吲哚乙酸(IAA)平衡失调，进而导致胚胎败育^[34-35]；类黄酮类—多酚类化合物对脂质代谢物具有调控作用^[36]，能够影响稻草^[37]和野樱梅^[38]胚乳脂质代谢，造成胚乳中营养物质积累异常，进而影响整个种子的发育。类黄酮类—多酚类化合物还可通过调控microRNA表达，对种子发育必要调控基因的表达造成影响^[39]。

总之，类黄酮类—多酚类化合物在涩籽发生过程中明显异常积累，但其具体作用的研究尚未开展。在胚胎败育发生之后，涩籽种胚为何不像瘪粒一样退化消失，而形成与健籽相似的外观形态？在涩籽种胚败育之后，是哪些组织仍然具有细胞活性，不断进行类黄酮类—多酚类化合物的生物合成？这些代谢物是否由母株输送？这些问题都未得到很好的解释。涩籽的形成是一个物质积累的过程，必然消耗能量与养分。杉木为何在漫长的进化过程中仍旧保留了涩籽这一看似没有任何“回报”的性状？有研究认为，植物种实中单宁类物质可以影响动物取食倾向，防御鸟类^[40-41]、啮齿类^[42]等取食，对种子扩散造成影响^[43-44]。涩籽是否也有防御鸟兽昆虫，保护健籽的生物学意义？目前尚无研究报道。此外，涩籽中的氨基酸、有机酸、脂肪酸和植物激素类的组分含量也与健籽存在明显的差异^[31]。

4 涩籽的生理生化变化 4.1 有机大分子含量

杉木涩籽发生的过程伴随着显著的生理生化变化。首先，涩籽中的蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质等有机大分子含量明显下降^[45]。郑郁善等^[46]发现，涩籽中的可溶性糖和游离氨基酸含量明显低于健籽；高智慧等^[10]研究发现，涩籽中的总核酸、总蛋白和类脂等自败育早期起就显著低于健籽。核酸、蛋白和类脂是细胞核与细胞膜的重要组分，是维持细胞必要生理活动的基本保证。健籽中核苷酸和氨基酸类代谢物的含量随种子发育而逐渐增加^[47]；但涩籽中核苷酸和氨基酸的含量极低，表明其可能由于胚胎败育导致有机大分子的积累受到影响，细胞活性受到抑制，遗传物质合成减少。这说明在涩籽物质积累过程中，组织细胞处于持续失活状态，也反映出涩籽体积增大并不是正常的生理发育现象。另外，涩籽中的脂质含量也明显低于健籽，后胚期涩籽中的粗脂肪含量仅为健籽的一半，至成熟期其比例下降至健籽的1/4左右^[25]。脂质作为细胞膜系统的基本结构元素，在细胞间信号转导中发挥着至关重要的作用^[48-49]；同时也是植物种子能量储备的主要形式^[50-51]。脂质代谢物显著下降反映了涩籽膜系统受到破坏，或活性缺陷后胚胎组织受损造成的活细胞减少。

4.2 氧化酶活性

由原胚期至胚成熟期，涩籽中的过氧化物酶活性逐渐降低，且均低于健籽，尤其是在胚成熟期时其活性仅为健籽的13.70%左右；同时后胚期涩籽中脂肪酶活性则显著升高^[52]。伴随着氧化酶系与脂肪酶活性的变化，涩籽中的丙二醛(MDA)含量和细胞膜透性均显著上升，而呼吸强度则显著下降^[25]。由此说明涩籽的氧自由基活跃程度较高，细胞膜结构出现损伤，同时氧化酶系活性的降低阻滞了组织内氧自由基清除效率，使得脂质氧化而产生MDA，最终导致涩籽组织的坏死。

4.3 内源激素含量

不同类型植物激素相互作用形成调控种胚成熟的复杂网络。涩籽的激素调控模式有别于健籽。陈宇^[31]研究表明，涩籽中生长素合成受到抑制，玉米素可能出现形态变化而影响活性。另外，与种胚发育相关的赤霉素在涩籽中均被分解或钝化，而脱落酸的含量却大大高于健籽^[10]，表明涩籽种胚可能提前进入衰老^[53]，进而影响下游代谢途径最终导致败育。

5 涩籽形成的分子调控

近年来，一些分子生物学手段逐渐应用于杉木涩籽形成的研究。王培等^[54-55]克隆了类黄酮生物合成途径中的2个重要基因：无色花青素还原酶基因ClLAR和花青素还原酶基因ClANR。在不同涩籽率类型家系中，ClANR的表达活跃期不同。授粉后90~100 d时，高涩籽率家系ClANR的表达量显著高于中、低涩籽率家系；在80 d时，低涩籽率家系的表达量较高。理挪等^[56]克隆了杉木中调控油菜素内酯生物合成的类固醇5α-还原酶基因(ClDET2)。6—7月ClDET2的下调表达可能与涩籽胚珠发育异常有关。

上述研究仅涉及少数基因。综合遗传影响因素和形态学证据来看，尚有许多问题需结合分子生物学手段展开深入研究。如涩籽胚胎败育是否受到母本特定基因的调控，使其在大孢子雌配子体发育阶段就已经产生败育，或是在大小孢子体受精时受到隐性基因纯合的影响而造成某些家系的涩籽发生率相对稳定；是哪些外部环境因素触发了相应的分子调控开关，使得杉木在某些地区的涩籽率明显升高，这些都有待于进一步的研究。

6 展望

杉木涩籽形成经历胚胎败育和涩籽物质积累两过程。授粉后在遗传调控和环境影响下，雌配子体发育不健全而造成胚胎败育、胚珠萎缩解体和组织结构受损。同时，败育还造成氨基酸等必需代谢物合成水平受到抑制，导致抗氧化酶系活性下降，加剧氧化造成的影响。另一方面，以类黄酮类—多酚类代谢产物为主要组分的涩籽物质开始在近珠孔端出现，并逐步向下积累扩散，最终填充整个种腔，形成涩籽。

当前组学检测技术应用日益广泛，以基因组、转录组、代谢组、蛋白组等技术手段开展相关研究，是进一步揭示涩籽形成机制的有效方法，但也面临着一些困难。例如取材方面，由于发育初期的种胚十分微小，无法判断其为涩籽或是健籽，因此无法针对涩籽发生的起始时期深入开展调控基因的筛选工作。另外，由于杉木生长速度慢，结籽年限长，加之遗传转化体系未完全建立，使得验证工作难度较大。有鉴于此，未来研究中可以考虑采用融合冷冻切片技术、单细胞转录组和多组学联合分析等更为先进的技术，精准把握涩籽发生的起始时期，从而准确定位关键调控基因，构建影响涩籽形成的基因调控时序网络。另一方面，通过筛选杉木3代种子园中涩籽率表现显著差异的家系群体和已有的杂交试验林，利用群体转录组技术和杉木基因组重测序测定数据，开发与涩籽性状高度相关的分子标记，进一步完善辅助基因调控网络构建的研究。在此基础上可进一步开发分子育种芯片，改善目前杉木种子园只注重生产性状的筛选，而忽略良种质量的现状，为杉木种子园良种高产稳产及品质提升提供新的思路与借鉴。