文章信息
- 王锦锋, 王忠, 吴鸿雪, 王长文
- WANG Jinfeng, WANG Zhong, WU Hongxue, WANG Changwen
- 冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫的研究进展
- Research progress on infection of bat moth larvae by Cordyceps sinensis
- 亚热带农业研究, 2018, 14(4): 284-288
- Subtropical Agriculture Research, 2018, 14(4): 284-288.
- DOI: 10.13321/j.cnki.subtrop.agric.res.2018.04.013
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文章历史
- 收稿日期: 2018-09-21
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是我国传统的名贵珍惜药材,与人参、鹿茸并称为我国三大补品[1]。冬虫夏草是由冬虫夏草菌侵染青藏高原高山草甸土中的蝙蝠蛾幼虫而形成的菌核与真菌子座复合体[2-4]。野生冬虫夏草的形成要求有严格的寄主及特殊的地理环境,目前只在中国、尼泊尔、不丹以及印度等4个国家生长,中国是最主要产区。野生冬虫夏草主要生长在我国的西藏、青海、云南、四川以及甘肃等海拔3 500~5 200 m的局部高山草甸地区,因此野生资源十分有限[5-6]。冬虫夏草自然更新能力低下,且近年对其掠夺式的采挖,导致了野生自然资源濒临灭绝[7-8]。当前,有关冬虫夏草菌侵染寄主幼虫的技术研究已有报道,但有关其侵染寄主昆虫的过程及侵入途径的报道尚少[9-16]。
本文综述了冬虫夏草菌侵染寄主幼虫的侵染途径、侵染方法、外部侵染环境条件以及侵染材料、龄期等方面的研究进展,以期为进一步探究冬虫夏草菌人工侵染及栽培发展提供参考。
1 冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫途径目前,主要的侵染途径有:体表侵染、口器侵染和气孔侵染[6, 11]。蒲蛰龙等[12]认为,冬虫夏草菌侵染寄主幼虫可能存在内向型和外向型两种途径。内向型指环境中的冬虫夏草菌以幼虫表皮为突破口,通过附着在幼虫体表上,然后基于某种机理进入幼虫体腔内;外向型指环境中的冬虫夏草菌通过定殖于幼虫所食植物的根系,随着幼虫摄食从口腔进入肠道,直至进入体腔,实现对寄主的感染。陆龙喜等[13]认为,冬虫夏草菌与其他虫生真菌类似,通过体表侵染进入钩蝠蛾幼虫体内,并验证得出,刚蜕皮的4~5龄幼虫最易被感染,感染率达90%左右。杨大荣等[14]研究表明,虫草菌主要以子囊孢子形式粘附在刚蜕皮4~5龄幼虫的体壁节间皱折处而进行感染,而后子囊孢子萌发长出微小芽管,穿入幼虫尚未健全皮肤功能的新嫩表皮,从而进入体腔形成菌丝体。涂永勤等[15]研究表明,冬虫夏草菌进入寄主幼虫体内的途径主要通过口器侵染。王忠等[16]研究表明,分生孢子是粘附在幼虫表皮,待分生孢子萌发后穿透幼虫表皮,继而在幼虫体内生长菌丝,而后形成僵虫。Bikash[17]研究认为,子囊孢子通过体表和口腔进行感染,即子囊孢子粘附在体表,进而在体外萌发,穿透幼虫体表长成菌丝,或通过口腔进入幼虫体内,进而在体内萌发,产出菌丝体,最终形成僵虫。
综上所述,目前研究中最有效的感染途径为口腔侵染和体表侵染。口腔侵染中以口腔注射最优,但这种途径会造成幼虫大量死亡;体表侵染途径以蜕皮期幼虫感染率最高。由于整个侵染过程很复杂,因此通过何种途径侵染最为有效至今尚无定论,还需进一步研究。
2 冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫方法目前,侵染方法主要有针刺、饲料喂食、表皮涂抹、浸泡、喷淋、激光照射等。王忠等[16]运用5种方法进行4~6龄幼虫侵染试验,结果表明,采用表皮涂抹法和喷淋法均能产生感染,采用浸泡、针刺、喂食法接种则不产生感染;涂抹法感染率高,且能产生虫草子座,而喷淋法感染率则相对较低,不产生子座。廖志勇[18]运用微枪注射法、喷淋法及饲喂法进行侵染试验,结果表明,采用饲喂法幼虫感染僵化率仅0.34%,可认为感染基本无效,这与王忠等[16]观点基本一致;采用喷淋法效果好一些,但依旧不理想;而采用微枪注射法,幼虫感染僵化率可达14.34%,但幼虫死亡率高。贺宗毅等[19]采用浸渍法侵染,3龄幼虫感染率达到26.7%。涂永勤等[15]运用表皮涂抹、注射接种(体壁注射、口器注射)和饲喂法进行侵染表明,表皮涂抹法可感染,但感染率低,仅14.06%;体壁注射法感染率有所提高,为34.04%;口器注射法感染率为80.10%;喂食法感染率达到80.77%,得出菌体从口腔进入寄主是感染冬虫夏草的主要方式,该观点与王忠等[16]、廖志勇等[18]有所差异。谢远泰[20]采用无创伤感染和幼虫自食虫草菌相配合的方法,得到的子实体营养和药用成分与天然虫草不相上下,正品率达到85%。陈威仁等[21]研究表明,激光照射法可快速及大量地感染冬虫夏草寄主幼虫。
总体上,已有侵染方法的研究结果间存在差异,有些观点甚至相对。目前采用注射法效果要优于其他侵染方法,但存在虫死亡率高的缺点;体表喷淋及涂抹侵染法使用较多,感染率也较高,若幼虫处在蜕皮期进行喷淋和涂抹侵染,将会增加感染率。
3 冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫的外部条件只有在特定的自然环境下才会形成冬虫夏草,因此,外部条件对冬虫夏草菌侵染幼虫的影响成为研究热点。外部环境主要包括:温度、湿度、光照等。
3.1 温度对蝙蝠蛾幼虫感染率的影响在一定范围内,温度对蝙蝠蛾幼虫的感染有一定的影响,适宜的温度能提高感染率。徐海峰[22]研究表明,在5~15 ℃下蝙蝠蛾多毛孢侵染拉脊蝠蛾的感染率随温度升高而逐渐升高;并得出10~15 ℃是冬虫夏草菌感染的最适温度。贺宗毅等[19]研究表明,随着温度的升高,菌体顶端生长萌发速度会随之加快,从而感染率也逐渐升高;当培养温度为14 ℃时,幼虫感染率显著高于其他温度。冬虫夏草菌来源于高原特有生物冬虫夏草,常年生长在低于20 ℃的环境中,Xing et al[23]认为冬虫夏草菌对温度较敏感,高温条件将影响感染率。王忠等[16]研究表明,幼虫感染率较高的温度为12~16 ℃,当超过16 ℃,感染率则降低,同时还认为感染率跟虫体蜕皮期有关。总而言之,冬虫夏草菌在10~16 ℃时,感染率最高。
3.2 湿度对蝙蝠蛾幼虫感染率的影响自然界中,冬虫夏草菌感染多发生在7—8月,这时虫草菌核部分开始腐烂,由子座弹射子囊孢子散落在地面上,孢子随雨水渗入土壤,在土壤中感染幼虫。由此可知,自然界中侵染是在较大的湿度环境中完成,因此湿度对幼虫的感染率有一定影响。刘礼平等[24]研究表明,土壤湿度在40%以上时,有利于虫草菌孢子侵染幼虫。王忠等[16]研究表明,高湿条件有利于提高感染率,湿度在65%~80%之间,幼虫感染率低于3.5%;湿度在80%~90%之间,感染率为6.0%~9.0%;湿度大于90%时,感染率为8.0%~15.0%;而湿度低于65%时则不感染。该观点与自然条件下冬虫夏草的形成情况相符合。朱寿东等[25]研究表明,冬虫夏草产量与降雨量有密切关系,雨量大,产量高,这结果与自然界中冬虫夏草的形成结果相一致。总体上,目前研究均认为冬虫夏草菌在湿度较高的环境下,更容易完成感染。
3.3 pH值对蝙蝠蛾幼虫感染率的影响人工培育冬虫夏草过程中,侵染材料主要为分生孢子及菌丝体(固体和液体)。侵染材料在酸性条件下培养,即培养基pH值在5.0~6.5之间,而虫体中侵染材料是在酸性还是碱性环境下完成侵染仍未知。因此,研究虫体的pH值及其变化是研究侵染幼虫的重要环节。李文佳等[26]研究表明,藏区不同龄期的蝙蝠蛾幼虫肠道pH值集中在9.69~10.99之间,冬虫夏草菌在偏酸性培养基中可正常生长,但在pH值为9.5~11.0的培养基中,生长明显下降或不生长;通过对受侵染虫体的组织切片进行荧光显微观察显示,冬虫夏草菌在寄生阶段能够以相同形态的虫草菌菌体在肠道内与血淋巴中正常生存、正常增殖;但在体外情况下,菌丝体并不能在肠道pH值环境下生长。
冬虫夏草菌在自然界中能成功侵染蝙蝠蛾幼虫,证明子囊孢子在进入虫体后能顺利萌发,并成功长出菌丝体。由此推断,自然界中子囊孢子在进入虫体后发生了某种转变,转化成了其他形态,比如虫菌体,才能继续存活;或子囊孢子在虫体上潜伏的过程中,慢慢适应了碱性环境,已驯化成适应碱性的菌株,然后在碱性环境下萌发,侵入虫体长出菌丝体,从而完成感染,形成僵虫。具体是何种原因造成酸性环境中培养的菌能在碱性环境中成功感染幼虫,还需进一步的研究。
4 侵染材料对蝙蝠蛾幼虫感染率的影响 4.1 侵染源人工培育冬虫夏草过程中侵染源主要有子囊孢子、分生孢子、固培菌丝体及液培菌丝体。徐海峰[22]进行单因素及组合侵染试验表明,4种材料中分生孢子侵染能力最强、感染率最高,得到侵染幼虫最佳组合为:分生孢子+液培菌丝体。贺宗毅等[19]研究表明,线状菌体制剂可提高侵染的机率,但过多的菌体容易产生扭结现象,反而影响感染率;在一定范围内菌体用量与幼虫感染率成正比,最佳菌剂量为4 g。
由于条件限制,要获取大量的子囊孢子比较困难,因此,用于侵染的研究材料多用分生孢子和菌丝体。大部分研究表明,使用分生孢子作为侵染材料的效果最好。可能由于分生孢子萌发需要一段时间,而这段时间是分生孢子适应虫体的过程,这样就提高了感染率,与虫体从感染到形成僵虫需要一段时间相一致。而菌丝体在酸性培养基中培养,再接种到碱性环境,势必不适应,从而使菌丝成活率大大降低,因此效果没有分生孢子好。
4.2 幼虫龄期虫草蝠蛾是蝙蝠蛾科蝠蛾属的一种多食性昆虫,在自然界中要完成1个完整的生活周期需4~5 a以上[27]。由于幼虫免疫活性跟幼虫发育时期具有相关性,其体表附着菌剂的能力以及被菌体所分泌的胞外酶降解的机理也存在差异。因此,不同龄期的幼虫感染率也不同[28]。贺宗毅等[19]研究表明,随着幼虫的生长,感染率逐渐上升,以3龄幼虫感染率最高(26.7%),显著优于其他龄期幼虫;而进一步生长老熟,感染率有所下降;1龄和5龄幼虫未检测出被感染的幼虫,因此推测可能是较嫩或老熟幼虫都不利于菌剂感染。涂永勤等[15]研究表明,寄主幼虫各个龄期都存在被侵染的可能,其中老熟(6龄)幼虫感染率最低(4.84%),3~4龄感染率最高(70%左右),各龄期幼虫感染率差异显著。刘礼平等[24]研究表明,蝠蛾幼虫被冬虫夏草菌寄生的自然感染率为2.6%~16.1%,4~5龄幼虫感染率最高,老熟6龄幼虫感染率低,3龄以下幼虫不被感染,并提出幼虫感染率与幼虫蜕皮期有关,蜕皮期感染率会升高,4~5龄幼虫易被感染可能与虫体内氨基酸及微量元素的组成有关。王忠等[16]研究认为,在适宜的温度下,4~6龄期刚脱皮幼虫感染率最高,人工饲养的蝠蛾幼虫与自然生长的幼虫周期存在差异;在对人工饲养的蝠蛾幼虫进行侵染试验时发现,寄主幼虫各个龄期都可被冬虫夏草菌感染,但仅6龄期幼虫感染后能顺利形成僵虫并长成冬虫夏草,其他龄期幼虫感染率低且不形成冬虫夏草。
综上所述,最高感染率集中在3~5龄期幼虫,此龄期幼虫生长旺盛、活动力强,体表容易产生伤口,且蜕皮频繁,因此更容易感染。6龄以上的幼虫已经老熟,活动力下降,表皮坚硬,且不再蜕皮,因此感染率很低。关于冬虫夏草菌对不同龄期幼虫的侵染机理,还需深入研究。
5 存在的问题及展望由于冬虫夏草具有良好的药用价值,已成为研究的热点[29-31]。冬虫夏草药理等方面取得了重要的研究进展[32-34],但关于侵染方面的研究依然存在一些技术上的问题[15, 19]。目前国内外对寄主幼虫感染冬虫夏草菌的技术研究不多,尚未取得大的进展。人工培育冬虫夏草的关键技术是如何使寄主幼虫感染上冬虫夏草菌,因此,如何提高感染率依然是技术难题[15, 35-36]。另外,如何使在酸性条件下培养的菌丝体在碱性环境的虫体中存活生长,也待研究[26]。
人工培育冬虫夏草产业化的成功,不仅有利于解决冬虫夏草野生资源严重短缺、生产难以为继的困境,还有利于提高冬虫夏草的质量、规范虫草市场、保护高原生态环境[6, 37-38]。目前,蛹虫草菌已实现人工栽培子实体并形成规模化生产。实现大规模人工培育冬虫夏草子实体及规模化生产仍需较长时间的研究[4, 39]。
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