秋石斛(Dendrobiurn hybrida)为兰科石斛属植物，原产于东南亚和西太平洋岛屿，大多数生长于热带潮湿的地方，常附生于树上或岩石上，属附生兰^[1-3]。我国秋石斛主要分布在西南、华南、台湾等热带、亚热带地区^[4-5]。秋石斛花色鲜艳，花序着花多，花期长达1个月且耐储运，已成为新的兰科切花品种^[6]。目前秋石斛主要通过分株繁殖，繁殖速度慢且成活率较低^[7]。已有的秋石斛组培研究大多以茎尖、叶片、茎段及花梗等作为外植体诱导原球茎，但由于所采用的外植体较小，难以大量获取且褐化严重，导致诱导增殖比较困难，后代出现变异的概率较大^[5-7]。本试验以比较容易获取的秋石斛茎段为外植体，拟建立其茎段组培快繁体系。

1 材料与方法 1.1 供试材料

试材于2017年10月取自福州于山风景区兰圃，取其生长健壮、饱满、无病虫害的秋石斛当年新生侧芽中部茎段为外植体。将外植体用湿纱布包裹，放入保鲜袋并存放于4 ℃冰箱内备用。

1.2 试验方法 1.2.1 外植体处理

将当年生健壮、饱满秋石斛植株茎节上的叶片去除，留约3 cm叶鞘，洗净；以节为单位切成段，留5 cm左右，上半段约留2 cm，下半段约留3 cm，用自来水清洗干净；加适量洗衣粉，自来水冲洗30 min，期间不断震荡。将浸洗后的茎段洗净，蒸馏水冲洗2~3次；置于超净工作台内，用体积分数为75%酒精消毒30 s后，无菌水清洗1~2次，用体积分数为0.1%升汞消毒10 min，无菌水冲洗3~4次，无菌滤纸吸干备用。

1.2.2 消毒时间对不定芽萌芽的影响

以MS为基本培养基, 所有诱导培养基均附加20 g·L^-1蔗糖、1.5 g·L^-1活性炭和7 g·L^-1琼脂，pH值5.7，121 ℃高压灭菌20 min；用0.1%升汞消毒茎段，分别消毒8、9、10、11、12 min。消毒完成后用无菌水清洗3~4遍。处理完毕后，分别接种到固体培养基中，每瓶接2个茎段，每处理接种10瓶，共20个侧芽，重复3次。设置培养室温度为(23±2) ℃，光/暗周期为12 h/10 h，光照强度1 000~1 500 lx。30 d后观察并统计各处理外植体污染率和萌芽率，比较不同消毒时间对外植体污染率及萌芽率的影响，确定升汞的最佳处理时间。污染率/%=(污染不定芽芽数/接种不定芽芽数)×100；萌芽率/%=(萌发不定芽芽数/接种不定芽芽数)×100。

1.2.3 芽诱导增殖培养

(1) 6-BA是秋石斛芽诱导的重要生长调节剂，适宜的6-BA浓度有利于不定芽的增殖。以MS+1 g·L^-1蛋白胨+0.1 mg·L^-1 NAA+1.5 g·L^-1活性炭为增殖培养基，将初代培养诱导出的秋石斛不定芽分别接种于添加不同浓度6-BA(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L^-1)培养基上。每瓶接2个芽，每处理接种10瓶，3次重复。30 d后，观察并统计不定芽增殖系数，以确定秋石斛的最适增殖条件。

(2) 添加适量有机添加剂，可以促进不定芽的增殖，并降低新生组织的褐变程度^[8]。以MS+2 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA+1 g·L^-1蛋白胨+1.5 g·L^-1活性炭为基本继代培养基，将初代培养诱导出的秋石斛不定芽分别接种于添加不同有机添加剂(80 g·L^-1土豆泥，10 g·L^-1香蕉汁，2 g·L^-1花宝一号、10 g·L^-1黄瓜汁，10 g·L^-1椰子汁)的培养基上。每瓶接2个芽，每处理接种10瓶，3次重复。30 d后观察并统计不定芽增殖系数，以确定秋石斛的最适增殖培养基。增殖系数=(培养后芽数-接种芽数)/芽数。

1.2.4 生根壮苗培养

IBA能够有效促进秋石斛不定芽生根。以MS+0.1 mg·L^-1 NAA+80 g·L^-1土豆泥+1.5 g·L^-1活性炭为基本培养基，将增殖培养的芽分别接种于添加不同浓度IBA(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg·L^-1)培养基上。每瓶接2个芽，每处理接种10瓶，3次重复。30 d后观察并统计不定芽的生根率，以确定秋石斛的最适生根壮苗培养基。生根率/%=(生根芽数/接种芽数)×100。

2 结果与分析 2.1 消毒时间对秋石斛侧芽萌芽的影响

由表 1可知，随着消毒时间延长，秋石斛外植体污染率逐渐降低。消毒时间为8 min时，污染率最高(30.7%)，12 min时污染率最低(10.9%)，可见消毒时间越长，消毒效果则越好。从表 1还可见，随着消毒时间延长，萌芽率大体上呈现先增加后降低的趋势，在10 min时达到最大(76.5%)，其次为11 min，两者差异不显著，且与其他处理达到显著水平，12 min时萌芽率则降低。综合考虑污染率及萌芽率，0.1%升汞最佳消毒时间宜选择10 min，其萌芽情况见图 1。

2.2 6-BA浓度对秋石斛不定芽增殖的影响

从表 2可见，6-BA浓度对秋石斛不定芽增殖有较大影响。在一定范围内，随着6-BA浓度升高，不定芽增殖系数逐渐提高，生长逐渐加快。6-BA为2.0 mg·L^-1时，增殖效果最佳，增殖系数达6.3，显著高于其他处理；超过2.0 mg·L^-1时，增殖系数下降，但不定芽生长仍较正常。因此，6-BA最佳浓度为2 mg·L^-1，高浓度对增殖有抑制作用。

2.3 有机添加物对秋石斛不定芽增殖的影响

从表 3可见，培养基中添加不同有机物，各处理之间的增殖系数差异显著。添加2 g·L^-1花宝一号的处理，增殖系数最低，只有2.2，且长势差、叶片发黄，出现严重的褐化；添加香蕉汁、黄瓜汁和椰子汁的处理均出现部分褐化，但添加香蕉汁的处理长势较好，黄瓜汁和椰子汁则长势一般；而添加80 g·L^-1土豆泥的处理，未出现褐变，长势好、叶片深绿(图 2)，增殖系数达到4.8，显著高于其他处理。综合来看，秋石斛不定芽增殖的最佳有机添加物是80 g·L^-1土豆泥。

2.4 IBA浓度对秋石斛生根壮苗的影响

由表 4可知，在一定范围内，生根率随着IBA浓度增加而提高。IBA为0.8 mg·L^-1时, 生根率最高(95%)，与其他浓度处理差异显著，且根系比较粗壮。从表 4还可见，平均根数呈现随着IBA浓度的增加先增加后降低的趋势，0.8 mg·L^-1时达最大值，与其他处理达到显著差异水平。因此，诱导秋石斛不定芽生根壮苗的最佳IBA浓度为0.8 mg·L^-1，此时根系粗壮、生长旺盛(图 3)。

3 小结

外植体消毒是植物组织培养的重要环节之一，应根据不同的外植体选择不同的消毒剂和消毒时间^[9]。本试验选用数量较多且易采集的秋石斛茎段作为外植体，该部位较为粗壮，消毒时不易坏死，但由于生长时间相对较长，容易产生内生菌与积累大量微生物，消毒相对较难^[9-10]。本试验消毒时留有部分叶鞘，接种时才剥去叶鞘，在保护外植体的同时提高了消毒难度。因此，对消毒剂的选择和消毒时间的掌握显得尤为重要。本试验表明，秋石斛茎段用0.1%升汞消毒的最佳时间是10 min，萌芽率达到76.5%。这和陆顺教等^[10]得出的秋石斛最佳消毒时间为6~14 min基本一致。

培养基中的植物激素对秋石斛组织培养的增殖影响较大，不同浓度激素处理的外植体存活率间存在明显差异。张晓申等^[11]研究表明，在一定范围内6-BA浓度越高，诱导效果越好^[4]。张彦妮等^[12]研究认为，6-BA在2.0 mg·L^-1时对秋石斛不定芽的增殖效果最佳；而钟士传^[13]认为，最适合的浓度是5 mg·L^-1[8]。本试验结果与张彦妮等^[12]的研究相一致，与钟士传^[13]研究差异较大，这可能与所采用的外植体部位不同有关。本研究表明，6-BA浓度为2.0 mg·L^-1时，萌芽率达到83%，且芽质量也较好。

周华伟等^[14]研究表明，有机添加剂对不定芽的增殖和褐变有较大影响，添加一定的活性炭能够降低褐化率，有利于不定芽的生长。本试验培养基中添加了适量有机添加剂，促进了不定芽的增殖并降低了新生组织的褐变程度。陈亚鸿等^[15]研究表明，在培养基中添加蛋白胨能够有效降低褐化率，添加椰子汁能够提高不定芽增殖率，这与本试验结果基本相同，而在土豆和椰子汁的选择上存在差异。本研究表明，提高秋石斛不定芽增殖系数的最佳有机添加物是80 g·L^-1土豆。

陈亚鸿等^[15]和罗岚等^[16]研究发现，在生根培养基中加入一定量的IBA对秋石斛根诱导有明显的促进效果，可大幅提高生根率。本研究表明，秋石斛生根最佳IBA浓度是0.8 mg·L^-1，生根率可达95%，与罗岚等^[16]研究基本相同。本试验在生根培养基中添加80 g·L^-1土豆泥对促进秋石斛生根进行复壮，得到了较好的效果(图 3)。