水稻细菌性条斑病(rice bacterial leaf streak, BLS)，简称为细条病，由黄单胞杆菌属稻生黄单胞菌条斑病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xooc)所引起。水稻细条病多发生在我国南方地区，也是广西的重要水稻病害之一^[1]。当发生病害时，能导致水稻减产15%~25%，严重时可减产40%以上^[2-3]，已成为我国水稻第四大病害，被澳大利亚、中国和美国等列为重要的检疫性水稻病害^[4]。当前对水稻细条病的研究主要涉及病害防治学、病原生物学、抗病育种学等，这些研究均需要鉴定水稻材料的抗性。因此，明确抗性鉴定方法能够更好地选育抗性品种。

目前在水稻细条病抗性鉴定中使用较为广泛的为方中达等^[5]提出的喷湿法和谢关林等^[6]改良的针刺法。肖友伦等^[7]认为，在大田接种时针刺法和喷湿法致病效率大致相同；农秀美等^[8]认为，喷湿法和针刺法发病率相同，但喷湿法发病较轻，针刺法发病严重，且以病斑长度作为测量标准比喷湿法更标准；谢仕猛等^[9]在室内水稻细菌性条斑病鉴定中发现，针刺法致病效果明显优于喷湿法。目前在甘蓝、白菜、拟南芥等寄主上接种可选用叶片压渗法^[10]，但在水稻接种上并未见相关报道。以上接种方法主要针对抗源筛选，它们在抗性基因定位中的适用性，特别是压渗法在水稻细条病的抗性鉴定中是否有优势，尚未见相关报道。由于不同鉴定方法可能对抗性鉴定结果有较大影响，故有必要对几种鉴定方法进行比较，以确定各方法的优缺点及适用范围。同时，与细条病病菌同属的白叶枯病通用的表型鉴定方法为剪叶法，故将此方法一并纳入讨论。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌株

采用广西水稻细条病优势生理小种GX01，由亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室何勇强教授提供。

1.1.2 水稻材料

以IRBB5作为抗性对照(CK₁)、9311作为感性对照(CK₂)。采用经前期工作初步鉴定存在抗感差异的8份水稻品系：RL₂、RL₄、RL₆、RL₈、RL₁₂、RL₁₄、RL₁₆和RL₁₈。以上10份水稻材料均由亚热带农业资源保护与利用国家重点实验室李容柏教授提供。

1.1.3 药剂

Tween-20，为表面活性剂，可以增强菌液的附着力。

1.2 试验方法 1.2.1 水稻种植

采用盆栽法，盆砵长宽为60 cm×40 cm，每盆10行，每行10株，每种接种方法设置3次重复。每行安排1个品种(系)，随机排列，做好水肥管理及病虫害防治工作，待长至四叶一心时取用。

1.2.2 菌液配制

参照洪登伟等^[11]的菌液配制方法，将筛选所用的菌株在NA培养基斜面上28 ℃活化48 h。挑取形态正常的单菌落接种到200 mL的NB培养基中，在28 ℃下200 r·min^-1培养至对数期，6 000 r·min^-1离心10 min，去上清，用无菌水将菌体配成悬浊液，并稀释至0.3×10⁹ CFU·mL^-1用于接种。接种菌液需现配现用。

1.2.3 接种方法与病斑调查

(1) 喷湿法。参考农秀美等^[8]的喷菌接种法并加以改进。先在准备好的菌液中加入体积比为0.05% Tween-20，混匀，然后将菌液装入按压式喷湿器，均匀喷湿在水稻叶片上。每盆接种100 mL，接种完毕后盖膜保湿24 h。待CK₂发病叶面积大于1/2时，观察每株叶片的发病面积。(2)剪叶法。参考方中达等^[5]的方法，选取生长良好的水稻叶片作为待接种叶片。先在准备好的菌液中加入0.05% Tween-20，混匀，将已灭菌的手术剪刀口沾取菌液，在距离叶尖1.0 cm处垂直于主脉剪下叶尖，并用无菌棉签蘸取菌液轻轻压在伤口上4~6 s，接种后盖膜。待CK₂发病叶面积大于1/2时，观察每株叶片的发病面积。(3)针刺法。参照谢关林等^[6]的方法。将2枚灭菌大头针固定于橡皮块上，2针间距0.6 cm，灭菌备用。在培养皿中放置直径9 cm、厚2 cm的吸水海绵，海绵吸饱菌液后，将距叶尖5 cm处的叶片放置于海绵碟上，用橡皮上的2枚大头针隔叶脉刺下，橡皮挤压海绵，保证针刺伤口接触到菌液，每株接2片叶子。接种过程中根据需要适当补充海绵碟中的菌液。接种完毕后盖膜保湿24 h。待CK₂病斑长度>3 cm时，测量接种点的病斑长度，每株调查4个病斑长度，取其平均值。(4)压渗法。参考梅雄等^[10]的方法。选取生长良好的水稻叶片，作为待接种叶片。接种时，叶片背面朝上，用灭过菌的1 mL注射器吸取之前准备好的菌液1 mL，去掉针头，用合适的力度将菌液轻轻压入叶肉细胞间隙。接种过后的叶片会在压渗过的位置出现明显的水浸润圈。每株接2片叶子，接种完毕后盖膜保湿24 h。待CK₂病斑长度>3 cm时，测量接种点的病斑长度，每株调查2个病斑长度，取其平均值。

1.3 统计与分析

采用DPS 7.5统计软件对试验数据进行统计分析，计量数据采用“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析 2.1 接种方式与病情分析 2.1.1 喷湿法

调查表明，RL₂、RL₄和RL₆的病斑长度和CK₁一致，病斑零星分布于叶面上，鉴定为抗病；而RL₈、RL₁₂、RL₁₄、RL₁₆和RL₁₈的发病情况与CK₂一致，鉴定为感病。但由于病斑分布不均，无法通过测量面积进行量化分级。3次重复的结果基本一致，稳定性强。

2.1.2 剪叶法

调查表明，随着接种天数的增加，剪叶伤口部位变黄，造成伤口部位出现2~3 mm的枯黄，水稻叶片病斑长度扩展极短，在表观上没有显著差异。因此，无法依据病斑大小进行抗性区分。

2.1.3 针刺法

调查结果见表 1。从表 1可知，10份水稻材料病斑长度间存在显著差异，可以区分抗性。RL₂、RL₄和RL₆与CK₁的病斑长度差异不显著，可判定该3份材料为抗病；RL₁₆和RL₁₈与CK₂的病斑长度差异不显著，可判定该2份材料为感病；RL₁₂、RL₁₄比CK₂病斑长，且均与CK₂差异显著，可判定该2份材料为高感；RL₈病斑长度介于CK₁和CK₂之间，且与其他水稻材料差异显著，由此可判定为中感。

2.1.4 压渗法

调查结果见表 1。从表 1可知，10份水稻材料病斑长度间存在显著差异，可以区分抗性。RL₄和RL₆与CK₁的病斑长度差异不显著，而RL₂又与RL₄和RL₆的病斑长度差异不显著，可判定该3份材料为抗病；RL₁₄、RL₁₆和RL₁₈与CK₂的病斑长度差异不显著，而RL₁₂又与RL₁₆和RL₁₈的病斑长度差异不显著，可判定该4份材料为感病；RL₈病斑长度介于CK₁和CK₂之间，且与其他水稻材料差异显著，由此判定为中感。

2.2 针刺法和压渗法接种发病情况的比较

4种接种方法发病情况表明，喷湿法和剪叶法无法进行量化分级，故进一步比较针刺法和压渗法。由表 2可知，除了CK₁、RL₁₆和CK₂外，其他7份水稻材料采用针刺接种法测得病斑长度的变异系数(CV)都大于压渗法。总体上，采用压渗法测得病斑长度变异程度要小于针刺法，采用压渗法接种精确度更高。

对针刺法和压渗法3次重复间病斑长度差异进行F测验。由表 3可知，采用针刺法接种，RL₁₂、RL₁₄和CK₂在不同重复间测量的病斑长度存在显著或极显著差异，其他7份材料差异不显著；采用压渗法接种，CK₁、RL₁₂、RL₁₆和CK₂在不同重复间测量的病斑长度存在显著或极显著差异，其他6份材料差异不显著。以上表明，细条病的发病程度受环境条件影响较大，无论采用针刺法还是压渗法，不同重复的测量结果存在一定的不稳定性。

对同一水稻材料2种接种方法间病斑长度差异进行t测验。由表 4可知，除RL₁₄外，其他水稻材料采用不同接种方法测量的病斑长度存在显著或极显著差异。总体上，同一水稻材料采用压渗法接种病情比针刺法严重，病斑长度大于针刺法。表明在采用这2种方法进行抗性鉴定时，不能采用统一病斑长度分级标准，而应分别与各自抗、感对照进行比较，才能做出准确判断。如表 1将8个水稻品系的病斑长度与抗、感对照进行多重性比较，两种方法均将RL₂、RL₄和RL₆鉴定为抗性、RL₈鉴定为中感，而将其他4份材料归为感或高感类别。可见，采用这2种方法对水稻材料的抗性级别鉴定结果基本一致。

2.3 4种接种方法操作性的比较

针对4种接种方法的操作性而言，喷湿法操作便利性、规范性好，可在大田大范围接种，省时省力；剪叶法操作简单，可用于大田大范围的接种；针刺法相对喷湿法操作更不方便，但是接种技术易于掌握，规范性较好，可在大田中等范围接种；压渗法操作比针刺法更复杂，技术要求较高，若操作不慎易将叶片中脉折断，而且不同人员接种时压入的菌液量难以一致，规范性较差，多人接种会造成人为误差，故适用于小范围接种。

3 小结

水稻细条病抗性资源筛选和抗性基因定位亟需可靠、高效的接种方法。方中达等^[5]比较了抽气接种、喷洒后保湿和刷接的方法，认为喷湿法最有效，最能反映自然界发病情况。文艳华等^[12]研究表明，针刺法与喷湿法在显病率上没有明显差异，且病情严重程度呈极显著正相关，从应用角度应选择更简便易行的喷湿法。夏怡厚等^[13]认为，针刺法以病斑长度作为病情定级标准，比喷湿法以病斑面积作为病情定级标准更简易、准确。本研究结果与以上研究者的观点一致。尚未见压渗法在水稻细条病抗性鉴定的应用性比较。本研究表明，针刺法和压渗法都可以准确区别水稻材料的抗感差异，但同一水稻材料采用2种方法测得的病斑长度存在显著或极显著差异。针刺法对叶片造成伤口，从伤口侵入，病斑纵向扩展快；压渗法通过挤压把菌液挤压入气孔，接种菌液量大，病情较针刺法严重，病斑长度比针刺法长。因此，在采用这2种方法进行抗性鉴定时，应分别与各自抗、感对照进行比较，才能做出正确判断。本试验采用针刺法和压渗法对8份水稻材料的鉴定结果基本一致，表明针刺法和压渗法鉴定结果都准确可靠。本研究还表明，无论是针刺法还是压渗法，对于一些水稻材料不同重复间病斑长度存在显著差异。由于细条病的发病情况受温度、湿度等环境条件影响较大，不同重复间小环境的差异会引起病斑长度的不同。因此，无论采用哪种接种方法都需要设置3次以上重复。

本试验比较了水稻细条病的4种接种方法。喷湿法接种可以区分抗性材料和感性材料, 但病斑分布不均匀，难以通过测量叶面积进行量化分级。喷湿法操作简单易行，可大批量用于水稻品种的初步鉴定，快速区分水稻材料间的抗感差异。剪叶法发病较轻或不发病，不适用于水稻细条病的抗性鉴定。针刺法接种发病率高，病斑发病严重。采用量病斑长度来衡量品种抗病性，可以对水稻材料进行抗性量化分级，可以用于抗性材料复筛和基因定位研究；压渗法接种发病率高，病情较针刺法严重，可以通过病斑长度对水稻材料进行抗性量化分级，准确性和精确性好。但由于压渗法操作繁琐、技术要求高，不及针刺法简便省时，更适于小范围的接种鉴定。