乌饭树(Vaccinium bracteatum Thunb.)为杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium L.)植物，多为常绿灌木，古称染菽，又名乌饭子、南烛、青精饭、十月乌等，是我国传统的中草药植物^[1]。越橘属植物全球约450种，其中我国约有91种，乌饭树是我国分布最广、蕴藏量最大的越橘属之一^[2]。乌饭树树高达1~3 m，多分枝，叶为椭圆形或长椭圆形，果实为球状小浆果^[3-4]，多喜酸性土壤，夏日叶色翠绿，秋季叶色微红，萌发力强，作为山地次生植被成分，是酸性红土壤的指示植物^[5]。

植物与微生物间的关系紧密而复杂，植物与真菌的共生现象十分普遍，超过80%的陆生植物根系有真菌共生现象^[6]。菌根(mycorrhiaz)是土壤环境中真菌与植物营养根系共生体的统称。杜鹃花类菌根又称(拟)欧石楠类菌根(ericoid mycorrhiza, ERM)，是指土壤真菌与杜鹃花科(浆果鹃属和熊果属除外)植物根系形成共生关系，是具有典型特征的一类菌根^[7]。刘小燕等^[8]研究表明，多种越橘属植物根系上均能发现内生菌根真菌；所有高丛蓝莓根系均能观测到菌根真菌，且部分可成功分离，其侵染可能对越橘的生长有益。袁军^[9]从野生乌饭根系中分离出了部分ERM真菌，但未深入探究野生状态下乌饭根系的菌根侵染率及侵染形态。本研究首次对野生乌饭越橘根系菌根真菌进行了初步的形态观察研究，并测定野生生境下乌饭根系菌根侵染率，以期为丰富杜鹃花类菌根真菌的研究及乌饭菌根真菌的进一步探索与利用提供参考。

1 材料与方法 1.1 样品采集与处理

采样地位于湖南省岳阳市汨罗市川山坪镇及郴州市汝城县土桥镇，两地呈南北两点分布，立地类型皆为山地。采样地概况见表 1，2个采样地均设置3个采样点，共计6个采样点。

2014年8—9月，分别采集2个样地野生乌饭越橘完整的根系及根际土样，用低温冷藏设施带回实验室，并立即存放于4 ℃恒温冰箱。取样时先用自来水洗净根系土壤，挑选幼嫩根系，用蒸馏水冲洗数遍并用吸水纸吸附表面水分，切下根尖或剪成均匀根段，备用。

1.2 方法 1.2.1 锥虫蓝染色法

采用锥虫蓝染色法^[10]对乌饭根系进行染色处理。取洗净的细根，剪取0.5~1.0 cm根段，于FAA固定液中处理24 h，蒸馏水冲洗数遍后放入10% KOH溶液(质量分数)中浸泡20 h进行漂白处理，将漂白好的根段用蒸馏水清洗干净，浸入1% HCl(质量分数)中酸化处理5 min，用0.2%锥虫蓝(质量分数)染色。分色后制作压片，于光学显微镜下观察菌根真菌侵染情况。

1.2.2 侵染率

随机挑选染色完全、粗细较均匀、长度为0.5~1.0 cm的根段50条，整齐放置于干净的载玻片上，压片。在光学显微镜200~400倍下观察各根段的侵染情况，根据视野中根段内染色的菌丝长度约占该根段总长度的百分比估算其侵染率，依次按0、10%、20%、……100%的侵染估算程度统计所有根段的侵染率，并计算样品的菌根侵染率。

菌根侵染率/%=Σ(0×根段数+10%×根段数+20%×根段数+……+100%×根段数)/总根段数^[11]

2 结果与分析 2.1 野生乌饭越橘菌根侵染率

野生乌饭越橘菌根侵染率见表 2。由表 2可知，2个采样地的6组根段菌根侵染率在38.60%~63.80%之间，大部分根样侵染程度较高，其中岳阳牛家坳、岳阳黄家坡、郴州黄家村3个样地的侵染率超过50%，侵染强度大；岳阳黄家坡根段侵染率最高，为63.80%，郴州黄家村次之，为53.20%，郴州青龙村最低，仅38.60%；岳阳金牛村、岳阳黄家坡、郴州青龙村均发现侵染率为0的根段；岳阳黄家坡侵染率≥50%的根段数有37根，其次是郴州黄家村，为36根；所有根系采样组均未观察到100%侵染的根段。乌饭根系菌根侵染率与土壤pH值有关，当pH为4~6时，侵染率随着pH的增大而提高；当pH>6时，侵染率随着pH的增大而降低。岳阳黄家坡和郴州青龙村采样地土壤类型同为黄壤，但两者的菌根侵染率呈现两级分化，差异极大，这可能与采样地的土壤pH值相关，过酸性土壤环境不适宜真菌生长，弱酸性条件更为适宜。

2.2 野生乌饭越橘根系形态观察

野生乌饭越橘根系形态见图 1。乌饭根系有细小的乳白色根系丛生(图 1A、1B箭头所示)，在土壤层常有白色丝状、絮状物体附着(图 1C箭头所示)；根尖端体洗净后呈微透明状，能粗略看到根尖分区，主要执行吸收功能的根表皮层脉络清晰，根尖底端颜色较深，可见深色的焦灼状根段(图 1D箭头所示)，这可能是土壤环境中的微生物造成的。在体视镜下，还可明显观察到乌饭根系侧生的毛根(图 1F箭头所示)。

2.3 野生乌饭越橘菌根真菌侵染形态

野生乌饭越橘菌根真菌侵染形态见图 2。根系中大部分根段均被菌根真菌侵染，侵染部位集中在根表皮细胞层，但随机选择的根段侵染强度存在差异，部分区域的表层细胞群均有侵染，部分区域是侵染和非侵染的表皮细胞交互存在。

2.3.1 外生菌丝

40倍物镜下，野生乌饭根系表皮处延伸出稀疏的根外菌丝，外生菌丝可通过1个点或多个点侵染根表皮细胞(图 2B、2C)。外生菌丝在同一根段上有多个侵入点时，多数是跨细胞侵入，这有利于细胞间营养的交换运输(图 2C)。

2.3.2 内生菌丝

图 2D~2F为内生菌丝生长情况。内生菌丝寄生于根系的皮层细胞中，同寄主植物根系细胞的原生质体混生。根内表皮细胞菌丝一般有2种类型，一是细胞内缠绕的菌丝团(图 2D、2F)，二是贯穿细胞间的菌丝体(图 2D、2E)。

2.3.3 根段表皮细胞缺失

野生乌饭根段表皮细胞缺失现象明显(图 2G~2I)。表层细胞多呈撕裂状，四周伴有大量菌丝，这一现象与张春英^[10]对云锦杜鹃菌根研究及袁继鑫^[11]对野生蓝莓菌根的研究结果一致，这是由于菌丝侵入细胞一段时间后，造成细胞原生质膜的破裂，细胞内含物分解，最终导致细胞的部分缺失。

2.3.4 菌根菌丝特异结构

在乌饭菌根真菌侵染形态观察中还发现了菌丝体特异结构(图 2J~2L)。一段根内菌丝呈现倒“Y”型结构，几乎贯穿整个根段，其中一端卷曲成环，增大了接触面，另一端略微伸出表皮细胞，这样的根内菌丝结构较为少见(图 2J)；在根系的分叉处，同一根段的分叉根系间形成了菌丝连接体，对根段的吸收能力有一定的提升(图 2K)；根外菌丝的两端同时侵入不同根段，像一座桥梁般连通了不相连根段或分枝根段, 根外的菌丝紧密缠绕，增大菌丝体通道的横切面积，促进不同根段间物质的运输和交换(图 2L)。

3 讨论与结论

本研究表明，湖南省南北2个地区的野生乌饭根系菌根侵染率在38.60%~63.80%之间，侵染率最大差值为25.2%。根段菌根侵染率与土壤pH值存在一定的关系，当pH为4~6时，侵染率随着pH的增大而提高，岳阳黄家坡土壤pH为5.82，其侵染率最大，为63.80%；当pH>6时，侵染率反而随着pH的增大而降低。可见，不同采样地野生乌饭的菌根侵染率存在较大差异，这可能与野生乌饭的生境密切相关。张春英等^[12]对杜鹃花类菌根研究认为，菌根真菌的侵入受土壤环境因子的影响极大，不同地区土壤pH、有机质差异大，土壤微生物群落复杂，土壤真菌与环境因素密切相关。刘凤红等^[13]从长白山笃斯越橘根系内分离出5个属8个种的菌株，其中Phialocephala spp.是优势属，占菌株总数的68.57%，侵染根系形成菌根结构的真菌种类差别巨大，相互间形成竞争，也是造成菌根侵染率差异的因素之一。

表皮层是研究杜鹃花类菌根不可缺少的结构^[14]。乌饭越橘菌根真菌侵染部位集中在根表皮细胞层，并引起表皮细胞缺失现象，在侵染过程中还形成菌丝特异结构。外生菌丝可通过一个点或多个点跨细胞侵染根表皮细胞，同一根段的分叉根系间形成了菌丝连接体，根外菌丝的两端同时侵入不同根段细胞，像一座桥梁般连通了不相连根段或分枝根段，这是首次观察到该类菌根真菌菌丝结构体(菌丝连接桥)。菌丝侵染点分布在不同的根段细胞内，菌丝紧密缠绕，增大了菌丝体通道的横切面积，对乌饭不同根段物质的运输和交换具有重要作用；内生菌丝在皮层细胞内缠绕成菌丝团或整个贯穿于细胞间，还观察到倒“Y”型结构，贯穿整个根段，增大了接触面，这有利于细胞间营养的交换运输。这些特异性结构表明菌根真菌与乌饭植物的相互作用方式多样，但具体的作用机理有待更深入的研究。