木薯(Manihot esculanta Crantz)别名树薯，为1年生或多年生大戟科木薯属植物，其茎干高大如灌木，块根似薯，是世界三大薯类作物之一^[1]。木薯素有“淀粉之王”、“地下粮仓”和“特用作物”的美称^[2]，其块根不仅是工业淀粉的主要原料之一，也是燃料乙醇的主要原料。木薯产业的发展对保护生态环境及缓解能源危机具有重要的意义^{[3, 4]}。木薯植株高大，种植时间长，耐贫瘠、干旱，吸肥力强，尤其对磷、钾肥需求量较大，多年单一连作地力消耗较大，土壤肥力有下降的趋势^[5]。

丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)是由球囊菌门真菌与植物根系形成的互惠共生体，约80%以上的陆地植物都能与AM真菌共生^[6]。AM真菌不仅能够促进宿主植物对水分和土壤矿质元素(尤其是磷、锌、铜等矿质元素)的吸收和利用，还能增强宿主植物对干旱、贫瘠、病虫害等不良环境的抵抗能力，改善土壤的理化性状，促进植物生长，提高作物产量和品质^{[7, 8]}。木薯为菌根依赖型植物，其根际土壤中富含AM真菌资源^{[9, 10]}。Phillips et al^[11]和Kormanik et al^[12]认为台酚蓝和酸性品红染色法染色效果可靠而稳定，但除了AM真菌被染色外，其根皮层组织也会被染上相同而略浅的颜色，使得AM真菌的结构与皮层组织颜色反差不大，不利于观察拍照。Vierheilig et al^[13]指出台酚蓝、酸性品红都是致癌疑似物，长期使用可能对操作者的健康有害。本课题组采用台酚蓝对大田木薯根系进行染色，除AM真菌被染色外，其根皮层组织也被染上相同而略浅的颜色，两者之间的颜色反差不明显，不利于AM真菌菌丝等结构的观察。因此，建立一种安全可靠的木薯根系丛枝菌根真菌染色方法很有必要。本研究以大田木薯根系为样品，比较酸性品红、台酚蓝、苏丹红、苯胺蓝、Quink牌纯黑墨水、北京牌蓝黑墨水等6种染色剂对其AM真菌的染色效果，建立安全可靠理想的染色方法，以期为木薯根系的AM真菌研究提供支持。

大田木薯根系取自广西南宁市武鸣县罗波镇岽周村木薯试验基地，冲洗后置于体积分数为50%酒精中室温保存。

①酸性品红：0.15 g酸性品红+100 mL乳酸+100 mL甘油+100 mL蒸馏水；②苏丹红Ⅳ：0.1 g苏丹Ⅳ+10 mL 95%酒精+10 mL甘油；③台酚蓝：0.15 g台酚蓝+100 mL乳酸+100 mL甘油+100 mL蒸馏水；④苯胺蓝：0.1 g苯胺蓝+100 mL 95%酒精；⑤2种墨水：95 mL 5%冰乙酸(体积分数)+5 mL墨水，配制成5%的墨水醋染液(体积分数)。

采用酸性品红、苏丹红Ⅳ、台酚蓝、苯胺蓝、Quink牌纯黑墨水、北京牌蓝黑墨水等6种染色剂进行根系菌根染色试验，浸染方法参考文献[14]并略作改进。取保存于50%酒精中的木薯根系，用清水冲洗干净，并将水分控干。将根系剪成约1 cm长，分装于不同的离心管中，加入 20% KOH 溶液完全浸泡，90 ℃水浴30 min，除去根部皮层细胞的细胞质，利于染料的浸透，清水冲洗3～5 次并将水分控干。加入碱性 H₂O₂(10 mL 10% H₂O₂+1 mL氨水+189 mL蒸馏水)室温脱色2 h，除去深色根系表层的颜色，同时软化根系，脱色结束后用清水冲洗3～5次并将水分控干。加5%冰乙酸，室温酸化5 min。用上述配制好的6种染色剂进行染色处理：66 ℃水浴染色30 min，用清水漂洗数次后，用清水浸泡12 h以上脱色。Quink牌纯黑墨水染色留两份材料，一份不加碱性 H₂O₂作为对照处理；另一份常温染色过夜，其余处理一致。

将脱色处理后的根段平展于载玻片上，挑出根中的坚硬组织，用尖嘴镊子将木薯根外皮与内皮轻轻分开。每片平行摆放3～4个根段，盖上盖玻片，用镊子轻轻敲压使其平展均匀。每个处理制片3张，3次重复。使用尼康Ci-L显微镜观察、拍照。

由图 1可知，用酸性品红染料进行染色后，木薯根内的菌丝染上极浅的颜色，背景也染上相近的颜色，对比非常不明显，菌丝很难观察。不同种类的泡囊染色效果不尽相同，有些染上很浅的颜色，有些则能观察到泡囊的内含物。

	A-D.泡囊；E-F.泡囊内含物。 图 1 酸性品红染色木薯丛枝菌根 Figure 1 The arbuscular mycorrhiza, dyed with acid fuchsin, in cassava
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苏丹红Ⅳ染色操作简便，效果可靠稳定不褪色，与背景对比差异大。不同种类的泡囊染色效果各异，有大红色、浅黄色、黑色等，还有些泡囊壁染不上色，而内含物却染成大红色或橙色，菌丝染成红色但数量极少(图 2)。

	A-B.菌丝及泡囊；C-E.泡囊。 图 2 苏丹红Ⅳ染色木薯丛枝菌根 Figure 2 The arbuscular mycorrhiza, dyed with Sudan red Ⅳ, in cassava
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用台酚蓝进行染色后，虽然可观察到菌丝和泡囊，但是由于根皮层组织也染上了相同或者相近的颜色，使得菌丝、泡囊颜色与背景颜色反差小(图 3)。

	A-B.菌丝及泡囊；C.泡囊。 图 3 台酚蓝染色木薯丛枝菌根 Figure 3 The arbuscular mycorrhiza, dyed with trypan blue, in cassava
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苯胺蓝染色后背景颜色很深，根内的杂质多被染色，菌丝染色效果不佳，且与背景色接近或是染色不连续，泡囊染色效果一般(图 4)，不利于泡囊与菌丝等结构的观察。

	A.整体染色效果；B-C.菌丝及泡囊。 图 4 苯胺蓝染色木薯丛枝菌根 Figure 4 The arbuscular mycorrhiza, dyed with aniline blue, in cassava
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墨水对木薯根系AM真菌的菌丝、泡囊和孢子等结构着色好，在低倍镜下就能观察清楚(图 5)。

	Quink牌纯黑墨水染色：A.整体染色效果；B-C.孢子及菌丝；D-E.泡囊及菌丝；F.菌丝。北京牌蓝黑墨水染色：G-H.泡囊；I.泡囊与菌丝。 图 5 墨水染色木薯丛枝菌根 Figure 5 The arbuscular mycorrhiza, dyed with ink, in cassava
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北京牌蓝黑墨水染色后，观察到的菌丝、泡囊等结构虽然染色效果较好，但背景也染上了相近而略浅的颜色，染上色的菌丝、泡囊等结构放置几日后逐渐褪色，染色效果不稳固(图 5G-5I)。

Quink牌纯黑墨水染色后，能清晰地观察到孢子、泡囊和菌丝等结构，这些结构均染成深紫色且边缘清晰，经清水浸泡后背景褪色效果好，反差大、清晰度高、染色效果极佳，适用于木薯AM真菌的染色和制片观察(图 5A-5F)。

为探讨Quink牌纯黑墨水对木薯根系的最佳染色方法，本研究设置以下处理：(1)正常处理，即20%的KOH溶液90 ℃水浴30 min，碱性H₂O₂室温脱色2 h，5%冰乙酸酸化5 min，5%墨水醋(Quink牌纯黑墨水)66 ℃水浴染色30 min，清水浸泡脱色12 h；(2)常温染色过夜，其余处理一致；⑶不加碱性H₂O₂脱色，其余处理一致。试验表明：碱性H₂O₂脱色2 h能将其背景的棕黄色很好地褪色，背景颜色浅，利于观察(图 6A-6C)；而不加碱性H₂O₂脱色，其背景呈现棕黄色，颜色深，不利于观察(图 6G、6H)。常温染色过夜处理，菌丝、泡囊染色过深，边缘模糊不清晰(图 6D-6F)；而66 ℃水浴染色30 min，菌丝、泡囊等结构的染色效果良好，边缘清晰(图 6A-6C)。

	A-C.正常处理；D-F.常温染色过夜；G、H.不加碱性H2O2脱色。 图 6 Quink牌纯黑墨水染色木薯丛枝菌根 Figure 6 The arbuscular mycorrhiza, dyed with Quink pure black ink, in cassava
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本研究比较了6种染色剂对木薯菌根的染色效果，结果显示它们之间存在较大差异。酸性品红染色后，菌丝很难着色，几乎看不到，泡囊染上较浅的颜色，其中有些透明不易观察，有些则非常清晰地看到泡囊里的内含物。苏丹红Ⅳ染色效果稳定不褪色，与背景对比差异大，只有极少量菌丝能染成红色，大部分菌丝染得很浅或染不上颜色，不同种类的泡囊染色效果形态各异。台酚蓝染色后，菌丝和泡囊染色效果较好，但背景也染上相同或相近的颜色，不利于观察。苯胺蓝染色后背景颜色过深，且皮层杂质也染上较深颜色，菌丝和泡囊染色效果一般。北京牌蓝黑墨水染色后，泡囊与菌丝染上较浅的颜色，背景也染上同样而略浅的颜色，不便于观察，而且染色效果不稳固，持续褪色。Quink牌纯黑墨水染色后，AM真菌的孢子、泡囊和菌丝等结构均染成深紫色且边缘十分清晰，经清水浸泡过夜后背景褪色比较干净，各个结构与背景颜色反差大，染色效果极佳。齐宗韶^[15]研究表明，标准派克纯黑墨水由亮黑和坚牢黄2种染料组成，且均为食用色素，安全无毒。因此，采用Quink牌纯黑墨水染色可以兼顾好的染色效果和低毒安全。蓝黑墨水染色后持续褪色，Quink牌纯黑墨水却较稳固，这可能与墨水中的染料不同有关，有待进一步研究。

供试木薯根系多为老根，种植时间长，呈深棕色。要观察其内生真菌，不仅要使根系的菌丝和泡囊结构(AM真菌)染好颜色，还要将较深的背景颜色褪去，使两者产生较大的反差，便于观察，因此根系的脱色是试验中至关重要的环节。有些植物根系呈乳黄色至乳白色，仅使用KOH溶液透明处理即可^[16]，对于根系颜色较深的，应加以漂白处理^[17]。本试验采用碱性H₂O₂脱色漂白2 h，与不加碱性H₂O₂脱色(CK)相比，对木薯根皮层组织的棕黄色褪色效果显著，使其背景颜色变浅，便于观察。因此木薯根系5%墨水醋染色，添加碱性H₂O₂脱色十分必要。 除墨水外其余4种染料均有毒性，部分是致癌疑似物，价格也比较高，不适合长期使用，且操作时要谨慎小心。因此，采用Quink牌纯黑墨水对木薯根系进行染色，染色效果稳定可靠且反差大，适合木薯根系AM真菌的侵染检测、制片和观察，而且成本低廉、安全无毒，对环境污染小。