铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall. ex Lindll)，属兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobbium)多年生附生型草本植物，主要分布于安徽、浙江、福建等地。铁皮石斛是我国的名贵中药，其味甘、性微寒，具有益胃生津、滋阴清热、提高免疫力、抗肿瘤、延缓衰老等功效^[1]。铁皮石斛药用部分是新鲜或干燥的茎，多糖是最主要的有效成分^[2]，石斛生理活性的强弱与其多糖含量有一定关系，常以其多糖含量高低来判断石斛类药材质量的好坏。

目前铁皮石斛多糖提取方法主要有水提醇沉法、超声波提取法和酶提法等3种。传统的水提醇沉法步骤繁多，提取率不高^[3]；超声波提取技术通过机械、热学及空化等作用，可提高提取率^[4]；酶提法利用酶水解细胞壁，使细胞中含有的物质充分溶解到水中，提取率大幅提高，是近年来应用比较广泛的提取技术^[5]。铁皮石斛的药理作用主要成分是多糖，为此，药理学研究上通常要尽量脱除蛋白质。Sevage法是经典的脱蛋白法，除蛋白较温和，可以多次使用，但同时会损失部分多糖成分。本研究探讨不同次数Sevage法对铁皮石斛脱蛋白率和多糖损失率的影响，以提高多糖提取率和纯度，为进一步研究铁皮石斛多糖的药理作用提供依据。

铁皮石斛新鲜茎秆购自康恩贝集团浙江济公缘药业有限公司。无水葡萄糖标准品由中国药品生物制品检定所提供(批号:110833-201205)，牛血清白蛋白V标准品购自上海源叶生物科技有限公司(批号：ZN0521LA15)，其他试剂均为分析纯，水为实验用的纯净水。主要仪器设备包括TDL-5A离心机(上海菲恰尔仪器分析有限公司)和T6新世纪722型可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

将新鲜铁皮石斛茎秆剪成3 mm长小段，杀青烘干至恒重，随后粉碎备用。称取1 g石斛粉末用滤纸包裹，加150 mL石油醚，用索氏提取器80 ℃回流提取1.5 h，脱去石斛中的脂肪。烘干后的药包加80%乙醇溶液150 mL，用索氏提取器95 ℃回流提取1.5 h，脱去石斛中的醇溶性单糖^[6]。参考唐政等^[5]及王培培等^[7]方法并略加修改。将烘干的药包放置于圆底烧瓶内，加入纯净水100 mL和1 g混合酶(0.5 g纤维素酶和0.5 g果胶酶)，50 ℃下回流提取135 min后，抽滤，滤液另存；滤渣加入40 mL蒸馏水70 ℃回流提取120 min，此步骤重复2次；合并3次滤液，将多糖提取液90 ℃灭活水解酶活性15 min后，离心取上清液。

准确称取100 mg葡萄糖标准品加入100 mL蒸馏水，振荡摇匀。用蒸馏水分别稀释为100、200、300、400、500 μg·mL^-1，各取2 mL分别置于5个干燥的试管中，以2 mL蒸馏水为空白对照。在冰浴中加入新鲜配制的硫酸蒽酮试剂6.0 mL，摇匀，置沸水浴中加热15 min，取出，冰浴冷却15 min，静置后测定D_{625 nm}，绘制标准曲线。以稀释40倍后的石斛多糖提取溶液1 mL为供试溶液，采用蒽酮比色法测定含量。

多糖提取率/%=(D_{625 nm}-0.027 1)/0.002×n×v×100 式中，n为提取液稀释的倍数，v为提取液体积/mL。

称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 90%乙醇中，加入85%磷酸100 mL，最后用纯净水定容至1 000 mL。准确称取100 mg牛血清白蛋白，溶于100 mL蒸馏水中，即为1 000 μg·mL^-1原液。用纯净水将原液分别稀释为20、40、60、80、100 μg·mL^-1。各取1 mL，分别置于5个干燥的试管中，以1 mL蒸馏水为对照。每个试管加入考马斯亮蓝G-250试剂5 mL。涡流混合，放置10 min，测定D_{595 nm}，绘制标准曲线。未稀释的石斛多糖提取溶液为供试品溶液，采用考马斯亮蓝G-250法测定含量。

蛋白含量=(D_{595 nm}-0.007 1)/0.006 2×v 式中，v为提取液体积/mL。

参考穆文静等^[8]Sevage法脱蛋白工艺。Sevage试剂(正丁醇∶氯仿为1∶4)与多糖提取液比例为1∶2，振荡20 min，在3 000 r·min^-1下离心3 min，取上清液，即得精制多糖溶液。测定不同次数Sevage法脱蛋白对铁皮石斛蛋白和多糖的影响，以确定最佳脱蛋白次数。

方差分析模型采用单因素有重复观察值，平均值多重比较采用SNK(Student-Newman-Keuls)测验。数据统计分析采用SAS 8.1数理统计软件完成。

绘制葡萄糖标准品标准曲线(图 1)，进行线性回归，得回归方程：y=0.002x+0.027 1，R²=0.997 6。由此计算铁皮石斛多糖为383.7 mg·g^-1，提取率为38.4%。该结果与文献^[5]报道结果相接近。

	图 1 葡萄糖标准曲线 Fig.1 Standard curve of glucose at D625 nm
图选项

铁皮石斛含有蛋白质。根据考马斯亮蓝G-250绘制的标准曲线(图 2)，得线性回归方程：y=0.006 2x+0.007 1，R²=0.999 3。由此计算铁皮石斛可溶性蛋白质含量为17.82 mg·g^-1，占1.78%。

	图 2 蛋白质标准曲线 Fig.2 Standard curve of bovine serum albumin at D625 nm
图选项

从表 1可见，Sevage法脱除铁皮石斛蛋白效果较明显，3次脱蛋白率分别为21.9%、29.9%、32.0%。多重比较表明，第1次脱蛋白率与第2、第3次脱蛋白率有显著差异(P<0.05)，脱蛋白率绝对值相差达8.0%-10.1%；第2与第3次脱蛋白率未见显著差异(P>0.05)。

从表 1可见，不同次数Sevage法脱蛋白后多糖损失率明显增加。3次脱蛋白后多糖损失率分别为28.3%、56.6%、62.1%。多重比较表明，第1次脱蛋白时多糖损失率与第2、第3次多糖损失率有显著差异(P<0.05)，多糖损失率绝对值相差达28.3%-33.8%；第2与第3次脱蛋白后多糖损失率未见显著差异(P>0.05)。

脱蛋白是多糖纯化的重要步骤。为获得较高的脱蛋白率和糖保留率，并且保持多糖较高的生物活性，选择合适的脱蛋白方法显得尤为关建。Sevage法是经典的脱蛋白法，具有操作简便、试剂廉价等优点，除蛋白较温和，可以多次使用，但同时会损失部分多糖成分。本研究探讨了不同次数Sevage法对铁皮石斛脱蛋白率和多糖损失率的影响，发现脱蛋白2次或2次以上，脱蛋白率提高不明显且多糖损失严重。为此，建议Sevage法脱蛋白以1次为宜，多糖提取率可达27.5%。本文采用酶解法结合Sevage法脱蛋白等工艺提取铁皮石斛多糖，具有较高的提取率和纯度，且工艺稳定、重复性好。