肝细胞癌（liver hepatocellular carcinoma, LIHC）是一种起源于肝细胞的恶性肿瘤。由于其生长和扩增速度较快，侵袭迁移能力较强，多数患者确诊LIHC时已经处于晚期阶段，丧失手术机会，严重降低患者的预后^[1-3]。肿瘤的发生和发展与肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的成分和性质密切相关，特别是肝癌细胞与其周围TME中星状细胞、纤维细胞、巨噬细胞、免疫细胞和血管内皮细胞等形成复杂密切的通讯网络，导致肿瘤细胞更易从原发灶向远处扩散和转移^[4-5]。其中，细胞外基质（extracellular matrix, ECM）是一个复杂的蛋白质和分子网络，为组织提供结构加固，并在包括肿瘤细胞粘附、迁移、增殖和分化等生物学过程中发挥重要作用。ECM的积累会促进癌症的发生、进展、转移和侵袭，进一步增加肿瘤微环境的基质硬度^[6-8]。此外，ECM可能成为化疗和免疫抑制药物的机械屏障，使肿瘤治疗更加困难^[9]。探索以ECM蛋白为靶点的新方法和机制可为肝癌诊疗提供新策略。

ECM硬度是肿瘤ECM的重要生物力学属性。多项研究表明，基质硬度与纤维蛋白、胶原纤维蛋白的沉积和相互交联密切相关。基质硬度的变化可引起TME的改变，进一步影响肿瘤细胞的增殖和迁移能力^[10-12]。参与ECM硬度的机械敏感蛋白较多，如Piezo1、Integrin家族、Yes相关转录蛋白1（Yes-associated transcription protein 1, YAP1）和瞬时受体电位阳离子通道V4（transient receptor potential cation channel V4, TRPV4）等，均可加速ECM组分的合成和沉积，进而促进ECM硬度的形成和发展，但其具体机制仍有待商榷^[13]。其中，Piezo1是一种机械激活的离子通道压电蛋白，可感受ECM中的基质硬度，诱导肿瘤发生转移，与多种类型癌症的发病机制有关^[14]。已有研究表明，Piezo1在多种恶性肿瘤中上调，且与患者的预后呈负相关^[15]，但其在LIHC中的具体机制仍不清楚。

YAP1在ECM的机械转导中发挥重要作用^[14]，可能被Piezo1和Integrin等蛋白和Ca²⁺信号调控，可前馈上调Piezo1表达，促进肿瘤发生与进展^[16-18]。YAP1是Hippo通路的一部分，主要通过下游效应子等转录共激活因子的核定位响应ECM环境并调节细胞增殖，诱导靶基因转录。YAP1激活亦可能通过刺激有氧糖酵解和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase 7, MMP-7）表达促进细胞迁移。然而，Piezo1和YAP1与LIHC的发生和发展的关系尚不明确，探究二者之间的作用机制和关系有望解决肝癌治疗的难题。因此，本研究采用生物信息学和分子生物学等方法，探讨机械离子通道蛋白Piezo1和YAP1在LIHC的发生、发展和重塑TME中的作用，进一步明确潜在作用机制，为开发新的治疗靶点和改善患者预后提供思路。

1 材料与方法 1.1 材料和试剂

PCR扩增引物序列由北京擎科生物科技股份有限公司合成。PrimeScript^TM RT Mix试剂盒购自日本宝日医生物技术有限公司，SYBR^TM Green Master Mix购自北京康润生物科技有限公司。Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂购自美国TargetMol公司。用于敲低细胞中Piezo1的小干扰RNA（small interfering RNA, si-RNA）序列（Si-1：5’-GCCUCAAGUACUUCAUCAATT-3’，3’-UUGAUGAAGUACUUGAGGCTT-5’；Si-2：5’-GGUCCUACCUUGACAUGCUTT-3’，3’-AGCAUGUCAAGGUAGGACCTT-5’；Si-3：5’-CCUCAAGAGCAUUGACUUUTT-3’，3’-AAAGUCAAUGCUCUUGAGGTT-5’）、敲低Piezo1的对照序列Si-NC（5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’, 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’）和转染试剂GP-Transfect-Mate购自上海吉玛制药技术有限公司。兔抗人Piezo1、YAP1和Vinculin多克隆抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。兔抗人核因子κB（nuclear factor κB, NF-κB）、磷酸化的NF-κB（phospho-NF-κB, p-NF-κB）、核因子κB抑制蛋白α（nuclear factor κB inhibitor alpha, IKB-α）、p-IKB-α、纤连蛋白（fibronectin）和胶原蛋白Ⅰ（collagen Ⅰ）多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）多克隆抗体购自上海艾博抗贸易有限公司。胰蛋白酶消化液、PBS和细胞冻存液购自苏州新赛美生物科技有限公司。细胞培养液购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 数据库分析

2024年8月10日使用肿瘤免疫分析数据库（Tumor Immune Estimation Resource, TIMER；http://timer.comp-genomics.org/timer/）、基因表达互作分析数据库（Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA；http://gepia.cancer-pku.cn/）、UALCAN数据库（https://ualcan.path.uab.edu/）、GeneMANIA数据库（https://genemania.org/）和DriverDBv3数据库（http://driverdb.tms.cmu.edu.tw/）分析Piezo1和YAP1在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库中的表达谱和临床特征。使用UALCAN网站分析TCGA数据库中泛癌和LIHC中Piezo1和YAP1表达。使用GEPIA数据库分析LIHC中Piezo1和YAP1表达的相关性。TIMER和GEPIA网站分析TCGA数据库中LIHC患者Piezo1和YAP1表达相关性和预后。GeneMANIA数据库分析Piezo1和YAP1的基因和蛋白互作网络。DriverDBv3数据库分析Piezo1和YAP1与TCGA数据库中不同亚型LIHC的关系。

1.3 细胞培养

人肝脏肿瘤细胞系HepG2和Hep3B购自武汉普诺赛生命科技有限公司。人高转移性肝癌细胞系MHCC97H购自上海碧云天生物技术股份有限公司。正常人肝细胞MIHA获取自西安交通大学第一附属医院，所有实验符合西安交通大学第一附属医院伦理委员会伦理要求（伦理审批号：LLSBPJ-2024-77）。所有细胞均培养于添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的细胞培养液中，在标准细胞培养箱中培养（37℃ 5% CO₂）。培养箱底部放置高压灭菌水保持培养箱的湿度。细胞培养的过程中保证细胞密度≤90%，每2~3天更换培养液。待细胞密度达到90%后，用PBS洗去残留培养液，加入胰蛋白酶消化液消化细胞，待细胞悬浮后加入新鲜培养液终止消化，小心吹打皿底的细胞并收集至离心管中。使用离心机1 000 r/min 3 min收集细胞团块，按照需求种植到新的细胞培养板中，或冻存细胞于-80℃冰箱中。

1.4 细胞转染

Hep3B和MHCC97H细胞分别分为Piezo1敲低对照组（转染Si-NC）和Piezo1敲低实验组三组（分别转染Si-1、Si-2和Si-3）。细胞进行传代并均匀种在6孔板中，使其隔天处于对数生长期且密度在40%~50%。在1.5 mL离心管中依次加入50 μL无血清培养液，5 μL Transfect-mate转染试剂。另取1个1.5 mL离心管依次加入50 μL无血清培养液和5 μL对应的si-RNA。2个离心管分别混匀静置15 min后，混匀成一管，继续静置15 min。将6孔板中细胞培养液更换成新鲜完全培养液，静置时间结束后将上述转染混合物均匀滴入细胞中，轻轻摇匀放入细胞培养箱中孵育48~72 h后提取RNA和蛋白验证敲低效率，之后重新接种细胞进行增殖和平板克隆试验。

1.5 提取RNA

利用购自上海飞捷生物技术有限公司的RNA快速提取试剂盒（Fast 200）提取RNA。所有操作在冰上进行以减少RNA的降解。用4℃预冷的PBS洗涤细胞后每孔加入500 μL的试剂盒RA2液，静置1 min，待细胞充分裂解。将细胞裂解物全部吸入内套管中，13 000 r/min高速离心1 min。弃掉外套管中的液体后重新加入500 μL洗涤液，13 000 r/min再次离心1 min，重复洗涤步骤。弃掉外套管中的液体后，不加洗液空转13 000 r/min再次离心1 min。将内套管放入新的无酶EP管中，在内套管吸附膜中间加入30 μL的溶解液，静置1 min后继续13 000 r/min离心1 min，获得细胞总RNA。

1.6 实时定量PCR

20 μL的RNA逆转录体系的构建体系为1 000 ng总RNA、4 μL 5×PrimeScript^TM RT Mix和无酶去离子水（补足至20 μL）。短暂离心混匀后放入PCR仪（Bio-Rad公司，美国），按照37℃ 15 min、85℃ 5 s和4℃ ∞的程序进行逆转录反应。总反应时长为20 min。逆转录产物用去离子水稀释20倍后进行实时定量PCR反应。构建体系为12.5 μL 2×SYBR^TM Green Master Mix、1 μL正向引物、1 μL反向引物和10.5 μL cDNA。Piezo1正向引物序列为5’-GGACTCTCGCTGGTCTACCT-3’，反向引物为5’-GGGCACAATATGCAGGCAGA-3’；YAP1正向引物为5’-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3’，反向引物为5’-TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT-3’。将体系依次加入8联管之后短暂离心混匀，使用CFX96实时定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国）进行qRT-PCR反应。反应程序为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环，信号采集；溶解曲线采集。PCR扩增和检测总时间约为1.5 h，之后利用Bio-Rad CFX软件进行表达量统计学分析。

1.7 提取蛋白

准备好的细胞用PBS洗涤3次，在冰上加入蛋白裂解液充分裂解，用细胞刮板刮下细胞后移入离心管静置10 min，放入4℃低温高速离心机15 000 r/min离心15 min，小心吸取细胞上清，并吸取10 μL用BCA法进行蛋白定量。剩余蛋白上清按照4∶1的比例加入5×蛋白上样缓冲液，振荡混匀后100℃金属浴10 min使蛋白变性，放入-20℃冰箱备用。BCA定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司。每个蛋白样品需配置200 μL试剂A和4 μL试剂B，混匀之后加入96孔板中，每孔再加入5 μL的蛋白样品，37℃水浴30 min，在振荡器上混匀之后用酶标仪测定562 nm波长处的吸光度值，根据标准曲线计算所测蛋白浓度。

1.8 蛋白质印迹法

配置15孔10%的SDS-PAGE预制胶。蛋白上样后电泳仪90~120 V进行电泳。110 V 120 min进行冰上低温转膜。转膜结束的PVDF膜泡入5%的脱脂牛奶中，室温摇床放置60 min封闭非特异性抗原位点。封闭结束后，裁取目的条带，放入配好的一抗抗体稀释液中，4℃摇床孵育过夜。隔天用TBST清洗目的条带3次，每次10 min。放入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的兔抗人IgG二抗（武汉爱博泰克生物科技有限公司）中，室温孵育60 min。继续TBST清洗3次，每次10 min，之后使用化学发光仪进行条带成像。

1.9 CCK-8增殖试验

胰蛋白酶消化好的细胞制成均匀的细胞悬液，细胞浓度调整为5×10⁴/mL，均匀种在96孔板中，每孔200 μL培养液含3 000~5 000个细胞，每组设置6个复孔。96孔板边缘用无菌PBS封边减少液体挥发对试验结果的干扰。将接种好的96孔板在细胞超净台中静置5 min，待细胞沉降到板底之后小心放入细胞培养箱过夜贴壁。分别在24、48和72 h之后，弃去原有培养液，每孔加入180 μL新鲜培养液并加入20 μL CCK-8工作液，继续孵育3 h，使用酶标仪设置波长450 nm进行吸光度值的检测。

1.10 transwell试验

提前融化BD基质胶，用无血清培养液1∶5稀释基质胶，将无菌transwell小室小心放入24孔板中，每个小室加入60 μL基质胶使其均匀铺在transwell小室的膜上，在细胞培养箱中静置4 h使其凝固。生长状态良好的细胞进行消化离心，用无血清培养液重悬备用。配置每200 μL无血清培养液含60 000个细胞的细胞悬液，在24孔板中每孔加入800 μL新鲜培养液，将铺有基质胶的transwell小室小心放入含有培养液的24孔板中。将准备好的细胞吹打均匀，吸取200 μL垂直滴加在小室中间，静置5 min后水平转移至细胞培养箱中培养48 h。然后从24孔板中取出小室，用4%的多聚甲醛固定10 min，无菌PBS小心清洗3次，再用0.1%的结晶紫溶液染色10 min，PBS清洗干净。用棉签小心擦拭transwell上室没有穿过膜的细胞后，室温晾干后用显微镜进行拍照。

1.11 平板克隆试验

取对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化。细胞悬液稀释到600~1 000个/mL，接种到6孔板。将6孔板放置在37℃细胞培养箱中培养约2周。出现肉眼可见的克隆时终止培养。PBS小心浸洗培养皿2次，加入4%多聚甲醛固定细胞15 min。去除固定液，结晶紫染色液染色10~30 min。用流水缓慢洗去染色液，然后空气干燥，拍照计数分析。

1.12 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0软件进行作图和统计学分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示。对于正态分布且方差齐性的计量资料，采用t检验进行分析。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 Piezo1的表达谱及其与LIHC临床特征的关系

TIMER网站评估TCGA数据库中泛癌中Piezo1表达显示，Piezo1在LIHC、膀胱癌、胆管癌和肾透明细胞癌等12种肿瘤中表达高于癌旁正常组织（均P < 0.05，图 1A）。UALCAN数据库分析LIHC组织中Piezo1表达表明，临床分期3期者高于1期，中高级别（G2~G3）者高于低级别（G1），无淋巴结转移（N0）者高于正常组织（均P < 0.01，图 1B~1D）。无淋巴结转移（N0）、肿瘤分期和分级水平较高的LIHC患者中，DNA启动子甲基化水平均低于正常肝组织（均P < 0.01，图 1E~1G），G3高级别肿瘤较G1低级别肿瘤甲基化水平更低（P < 0.01）。晚期和N1期亚组与其他组Piezo1表达水平比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05），可能与TCGA数据库晚期病例和N1期样本量有限有关。

2.2 YAP1的表达谱及其与LIHC临床特征的关系

TIMER数据库泛癌表达分析显示（图 2A），YAP1在LIHC和胆管癌等肿瘤中的表达水平高于癌旁正常组织（均P < 0.05）。UALCAN数据库分析YAP1表达水平与LICH临床特征的关系显示，YAP1在1~3期和G1~G4级LIHC患者中表达水平比正常组织更高（均P < 0.01，图 2B~2C），3期患者较1期患者YAP1表达升高（P < 0.05，图 2B）。无淋巴结转移（N0）患者YAP1表达水平高于正常肝组织（P < 0.01，图 2D）。N0、2~3期和G1~G3的LIHC患者YAP1启动子甲基化水平较正常肝组织更低（均P < 0.01，图 2E~2G）。

2.3 Piezo1和YAP1协同表达降低LIHC患者的预后

GEPIA数据库分析显示，LIHC中Piezo1和YAP1蛋白表达呈正相关（r=0.19，P < 0.01；图 3A）。TIMER数据库分析结果与此一致（r=0.275，P < 0.01；图 3B）。TIMER数据库分析显示，Piezo1和YAP1高表达的LIHC患者较低表达患者预后均更差（P < 0.05，图 3C~3D）。GeneMANIA数据库分析Piezo1和YAP1的基因互作关系发现，二者与多种基因如转录增强相关结构域（transcriptional enhanced associate domain, TEAD）家族和大型肿瘤抑制因子（large tumor suppressor, LATS）家族等表达的蛋白具有丰富的通讯关系（图 3E），形成复杂的基因互作网络。DriverDBv3数据库分析显示，Piezo1和YAP1在LIHC原发肿瘤中的表达水平均高于正常肝组织（均P < 0.01，图 3F~3G）。TIMER数据库分析显示，Piezo1（r=0.331，P < 0.01）和YAP1（r=0.377，P < 0.01）与肿瘤相关成纤维细胞浸润水平均呈正相关（图 3H~3I）。

2.4 Piezo1和YAP1协同表达促进肝癌细胞增殖和侵袭

qRT-PCR结果发现，Piezo1和YAP1在肝脏肿瘤细胞系MHCC97H、Hep3B和HepG2中的表达水平均高于正常肝细胞MIHA（均P < 0.05，图 4A）。利用si-RNA技术敲低MHCC97H和Hep3B细胞中的Piezo1，通过qRT-PCR证实Piezo1被成功敲低约50%（图 4B）。蛋白印迹法也证实在2种细胞系中Piezo1被敲低，YAP1表达也被抑制（图 4C）。蛋白印迹法发现，敲低Piezo1可以抑制NF-κB和IKB-α的磷酸化（图 4D），也抑制ECM主要成分fibronectin和胶原蛋白Ⅰ（collagen Ⅰ）的表达，从而减少肿瘤外基质成分的积累，降低肿瘤基质刚度（图 4E）。

CCK-8实验发现，敲低Piezo1的MHCC97H和Hep3B细胞的增殖速率均降低（均P < 0.01，图 5A）。transwell小室细胞侵袭实验发现，敲低Piezo1后MHCC97H和Hep3B细胞的侵袭能力亦下降（图 5B）。平板克隆试验显示，敲低Piezo1后MHCC97H细胞形成克隆的能力亦下降（P < 0.01，图 5C~5D）。

3 讨论

Piezo1是机械门控阳离子通道家族成员之一。Piezo1可以被ECM中的机械刺激激活，也可被蛋白质-蛋白质相互作用激活^[19]。研究发现，Piezo1可以将ECM基质硬度相关的机械力与细胞信号通路联系起来，尤其是Ca²⁺信号^[20]。YAP1作为基质硬度的下游敏感指标，可感知和响应机械力学信号和Ca²⁺信号^[21]。Piezo1和整合素激活之间的机械正反馈回路形成双稳态开关调节Ca²⁺和YAP下游信号，进一步导致心脏成纤维细胞纤维化^[22]。细胞内Ca²⁺浓度控制肿瘤细胞的增殖、血管生成、迁移和侵袭等生物学过程。Ca²⁺内流可促进整合素复合物组装和ECM重塑等^[23-24]，并进一步上调细胞中的YAP1。细胞质Ca²⁺可反应Piezo1激活的程度，作为Piezo1和YAP1相互通讯的媒介，进一步增强Piezo1/YAP1信号重塑TME的能力^[25-26]。因此，Piezo1和YAP1可通过细胞内的Ca²⁺信号作为媒介，相互协调增强ECM的相互作用、组织、粘附和胶原结合，进一步促进LIHC的恶性发展和侵袭转移。

此外，ECM基质细胞可分泌转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）等，导致ECM成分如胶原蛋白和纤连蛋白等过度沉积交联，进一步增强ECM硬度^[27]。而增强的基质刚度可诱导肿瘤快速增殖和存活，并增强肿瘤细胞的干性、抗凋亡与自我更新能力、迁移能力和肿瘤耐药性等。因此，肿瘤细胞和ECM相互通讯串扰，协同促进肿瘤的生长和转移^[28]。研究表明，机械力学信号Piezo1的激活可激活NF-κB导致YAP1易位到细胞核中，通过与TEAD转录因子的相互作用激活下游基因表达，进而通过诱导结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）等促进生长和转移来驱动肿瘤的发生和进展^[29]。因此，Piezo1和YAP1相互影响可能成为肿瘤治疗的串联靶点。本研究结果也证实，Piezo1可激活NF-κB信号通路。狼蛛毒液衍生肽可选择性抑制Piezo1等阳离子机械敏感离子通道，但仍未进入临床研究。而维替泊芬已被广泛用作YAP抑制剂，且临床前研究表明，维替泊芬可有效抑制多种癌症^[30]。在复发高级别表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）突变胶质母细胞瘤和晚期胰腺癌患者中，使用维替泊芬进行光动力治疗的Ⅰ/Ⅱ期临床研究正在进行^[31]。因此，靶向Piezo1和YAP1在肿瘤靶向治疗领域展现出巨大潜力。

本研究发现，Piezo1和YAP1在LIHC患者中高表达，并与LIHC的分级、分期和淋巴结转移程度和肿瘤DNA甲基化水平密切相关。Piezo1和YAP1的表达在LIHC中表现出良好的线性相关性，二者相互协同促进肿瘤相关成纤维细胞浸润，共同导致LIHC患者的不良预后。Piezo1和YAP1在肝癌细胞系中高度激活，Piezo1通过调控NF-κB信号促进YAP1的表达，相互协同增强肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力，进而重塑ECM，促进肝癌的恶性进展。因此，靶向Piezo1/YAP1轴有望为LIHC患者提供新的治疗策略和思路。

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