肝癌是全球发病率第5位和死亡率第3位的恶性肿瘤，5年生存率 < 20%^[1-2]。代谢重编程与异常增殖是肝癌进展的两大标志^[3]，其中糖酵解通路的异常激活（即Warburg效应）为肿瘤细胞提供能量与合成原料^[4]，而该过程的上游调控机制亟待深入探索。非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）在肿瘤代谢调控中扮演关键角色^[5]。环状RNA（circular RNA, circRNA）作为一类闭合环状ncRNA，通过海绵吸附微小RNA（microRNA, miRNA）参与基因表达调控^[6]。研究表明，circRNA可通过竞争性结合miRNA解除其对靶基因的抑制，进而调控肿瘤细胞的增殖、凋亡和代谢表型^[7]。然而，circRNA在肝癌糖酵解中的具体作用及其分子网络仍不明确。

磷酸果糖激酶肝型（phosphofructokinase liver type, PFKL）是糖酵解途径的限速酶。其表达异常与肝癌细胞的糖代谢重塑相关^[8]。PFKL可通过促进葡萄糖摄取与乳酸生成维持肝癌细胞的恶性增殖。其上游的转录后调控机制尚未完全阐明。miR-338作为一类具有抑癌潜能的miRNA，已被证实可靶向多个癌基因参与肿瘤进展调控^[9]，但miR-338是否通过调控PFKL影响肝癌糖酵解仍需验证。本课题组前期研究发现，肝癌细胞外泌体中的circFBLIM1（hsa_circ_0010090）可通过抑制miR-338并上调低密度脂蛋白受体相关蛋白6（low-density lipoprotein receptor-related protein 6, LRP6），促进细胞糖酵解和肝癌进展^[10]。基于此，笔者提出假设：肝癌细胞内circFBLIM1可能通过吸附miR-338，解除其对糖酵解关键酶PFKL的抑制，从而促进肝癌细胞增殖并抑制凋亡。因此，本研究从细胞表型和分子表达层面系统解析肝癌细胞中circFBLIM1/miR-338/PFKL轴的调控作用，为阐明circFBLIM1在肝癌中的作用机制提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 细胞、试剂和仪器

人肝癌细胞系SNU-387和Huh-7购于武汉尚恩生物技术有限公司。人正常肝细胞系THLE-2购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

细胞增殖-毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8, CCK-8）检测试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白浓度测定试剂盒和增强化学发光（enhanced chemiluminescence, ECL）试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。RNA提取试剂购自苏州优逸兰迪生物科技有限公司。RNA EX Buffer购自深圳默鸿科技有限公司。SweScript All-in-One RT SuperMix for qPCR（逆转录试剂盒）和2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix购自武汉赛维尔生物科技有限公司。鼠源PFKL抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。兔源β-actin抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记山羊抗兔二抗和HRP标记山羊抗鼠二抗购自上海碧云天生物技术股份有限公司。

CO₂培养箱（LC-CBG-80S）购自湖南力辰科学仪器有限公司。微量高速离心机（D1012U）购自北京大龙兴创实验仪器股份公司。酶标仪（SP0101C2403071001-150W）购自上海闪谱生物科技有限公司。化学发光成像系统（EN61326-1）和实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）仪（7500 System）购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 细胞培养

SNU-387和Huh-7细胞分别采用RPMI-1640和DMEM高糖培养液培养。THLE-2细胞采用THLE-2细胞专用培养液CM-0833培养。所有细胞培养液均添加体积分数10%的胎牛血清。待培养瓶内细胞汇合度达80%~90%时作传代处理：弃去原有培养液，加入2 mL PBS清洗细胞；加入胰蛋白酶消化液室温消化2 min，终止消化后收集细胞悬液，1 000 r/min离心3 min；重悬细胞后接种至对应完全培养液，置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱常规培养。

1.3 qPCR检测circFBLIM1、miR-338和PFKL表达

细胞接种培养至对数生长期时，收集细胞，使用trizol法提取组织总RNA。采用逆转录试剂盒按照说明书步骤将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，在荧光qPCR仪上进行检测，预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火延伸60 ℃ 30 s，40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）为内参，2^-ΔΔ^Ct法计算circ-FBLIM1和PFKL的相对表达量。以U6为内参，计算miR338的相对表达量。引物序列见表 1。

1.4 circFBLIM1的沉默与验证

设计并合成针对circFBLIM1反向剪接位点的siRNA序列（si-circFBLIM1），同时合成非靶向阴性对照si-NC。将SNU-387细胞分为空白对照组（未做任何处理）、si-NC组（转染si-NC）和si-circFBLIM1组（转染si-circFBLIM1实现circFBLIM1沉默），以3×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，待细胞汇合度达70%~80%时，使用Lipofectamine^TM RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific公司，美国）将siRNA转染至细胞，转染后24 h收集样本。采用qPCR检测沉默效率，以及circFBLIM1沉默后细胞中miR338和PFKL的表达水平。

1.5 circFBLIM1过表达载体构建与转染

根据circFBLIM1（hsa_circ_0010090）的反向剪接序列设计特异性引物，通过PCR扩增目的片段，克隆至pcDNA3.1真核表达载体，构建circFBLIM1过表达重组载体。同时构建空载体pcDNA-NC（仅含载体骨架，无circFBLIM1序列）作为阴性对照。将SNU-387细胞分为空白组（未转染任何载体）、pcDNA-NC组（转染空载体pcDNA-NC）和pcDNA-circFBLIM1组（转染circFBLIM1过表达重组载体），以3×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，细胞汇合度为70%~80%时，使用Lipofectamine^TM 3000（Thermo Fisher Scientific公司，美国）按说明书转染，转染后24 h收集细胞。采用qPCR验证过表达效率，以及检测circFBLIM1过表达后细胞中miR338和PFKL的表达水平。

1.6 CCK-8实验检测细胞活力

将SNU-387细胞以4×10³个细胞/孔接种于96孔板内，细胞汇合至80%，转染siRNA或过表达载体24 h后，PBS洗涤3次，向孔内加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育2 h后，450 nm波长处检测吸光度值，计算细胞活力。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

将SNU-387细胞以5×10⁵个细胞/孔接种到6孔板中，放入37 ℃、5% CO₂培养箱。次日，转染siRNA 24 h后，收集细胞，PBS洗涤3次，加入600 μL结合缓冲液重悬细胞。取100 μL细胞液，加入5 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-fluorescein isothiocyanate, Annexin V-FITC），和5 μL碘化丙啶（propidium iodide, PI）染液，室温下避光孵育15 min后，加400 μL结合缓冲液混匀，使用流式细胞仪进行检测。

1.8 细胞划痕实验检测迁移能力

将SNU-387细胞以5×10⁵个细胞/孔接种到6孔板中。根据分组转染相应siRNA或载体成功后，饥饿处理24 h。调整细胞密度，根据分组种板，以5×10⁵个细胞/孔接种到6孔板中。次日，待细胞长满后，用200 μL枪头垂直于孔板和画的标记线划2条垂线，使划痕与标记线相交，以形成的若干交叉点作为固定的检测点。弃去培养液，PBS轻轻润洗2~3次。加入无血清培养液，并在显微镜下拍照，作为0 h对照。放入37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。24 h后取出细胞，于显微镜下观察同一位置划痕宽度并拍照。

1.9 Western

blot检测PFKL蛋白的表达水平

使用裂解液裂解细胞30 min，14 000 r/min离心20 min分离上清，BCA法定量蛋白浓度，95 ℃金属浴5 min使蛋白变性，配置SDS-PAGE凝胶，每孔上样30 μg蛋白，电泳后，转至0.22 μm PVDF膜进行转膜，脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗膜3次，加入一抗：PFKL和β-actin，4 ℃孵育过夜，回收一抗，TBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次后，曝光并分析计算相关蛋白表达量。

1.10 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计学分析和制图。所有实验重复3次，结果以均数±标准差（x±s）表示。多组间的定量比较采用单因素方差分析（ANOVA）。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 3种细胞中circFBLIM1表达量的比较

qPCR实验显示，与正常肝细胞THLE-2比较，肝癌细胞SNU-387与Huh-7中circFBLIM1高表达（均P < 0.05），并且SNU-387细胞中表达量高于Huh-7细胞（P < 0.01，图 1），因此后续实验选用SNU-387细胞进行研究。

2.2 circFBLIM1沉默对SNU-387细胞活力和凋亡率的影响

qPCR检测验证，SNU-387细胞中成功沉默circFBLIM1，si-circFBLIM1组circFBLIM1表达低于空白对照组和si-NC组（均P < 0.01，图 2A）。CCK-8实验显示，si-circFBLIM1组细胞活力较si-NC组降低（P < 0.01，图 2B），表明沉默circFBLIM1抑制细胞增殖。流式细胞仪检测显示，沉默circFBLIM1后细胞凋亡率上升（P < 0.01，图 3）。

2.3 circFBLIM1沉默对SNU-387细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验显示，si-circFBLIM1组SNU-387细胞迁移能力较si-NC组减弱（P < 0.01，图 4）。

2.4 circFBLIM1沉默对SNU-387细胞miR338和PFKL表达的影响

糖酵解与肝癌发生和发展密切相关，因此分析circFBLIM1沉默对SNU-387细胞糖酵解途径关键基因表达的影响。结果显示，circFBLIM1沉默增加SNU-387细胞中miR338的表达，降低PFKL的mRNA和蛋白水平（均P < 0.01，图 5）。

2.5 circFBLIM1过表达促进SNU-387细胞增殖

qPCR实验验证SNU-387细胞中circFBLIM1过表达成功。pcDNA-circFBLIM1组circFBLIM1表达高于pcDNA-NC组和空白组（均P < 0.01，图 6A）。CCK-8实验显示，pcDNA-circFBLIM1组细胞活力较pcDNA-NC组升高（P < 0.01，图 6B）。

2.6 过表达circFBLIM1增强SNU-387细胞迁移能力

细胞划痕实验显示，过表达circFBLIM1 24 h后pcDNA-circFBLIM1组细胞迁移能力较pcDNA-NC组增强（P < 0.01，图 7）。

2.7 过表达circFBLIM1对SNU-387细胞miR338和PFKL表达的影响

SNU-387细胞中circFBLIM1过表达降低miR-338表达（P < 0.01，图 8A），升高PFKL mRNA和蛋白表达（均P < 0.05，图 8B~8C），提示circFBLIM1过表达可吸附miR-338并解除其对PFKL的转录抑制。

3 讨论

肝癌的发生和发展涉及复杂的分子网络调控。代谢重编程与ncRNA异常表达在其中扮演关键角色^[11]。本研究首次揭示，circFBLIM1通过靶向miR-338/PFKL轴，调控肝癌细胞糖酵解代谢与恶性表型，为肝癌机制研究提供新视角。既往研究多聚焦线性RNA或单个ncRNA在肝癌中的作用^[12-14]。circRNA作为一类竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA, ceRNA），因其通过海绵吸附miRNA参与基因表达调控的机制而逐渐受到关注。本研究发现，circFBLIM1在肝癌细胞SNU-387中高表达，且沉默circFBLIM1可有效抑制细胞增殖和迁移，并促进凋亡。这一结果不同于以往多数研究中circRNA在肿瘤中的促癌作用，如circHIPK3通过海绵miR-124和调节肝细胞癌中AQP3的表达来调节细胞增殖和迁移^[15]。本研究将circFBLIM1与糖酵解代谢直接关联，突破传统circRNA功能研究多集中于增殖和凋亡等表型的局限。本研究在SNU-387细胞中过表达和沉默circFBLIM1显示，circFBLIM1促进细胞增殖，增强迁移能力，下调miR-338表达，上调PFKL表达；明确circFBLIM1/miR-338/PFKL轴在肝癌糖酵解和恶性表型调控中的作用。

从分子机制层面，本研究首次证实，circFBLIM1可作为miR-338的分子海绵，解除其对糖酵解限速酶PFKL的转录抑制。PFKL作为Warburg效应的关键调控因子，在肝癌中的表达主要在转录水平被调控^[16]，而本研究揭示circFBLIM1/miR-338通过转录后调控影响PFKL表达。既往已有大量circRNA在肝癌中发挥ceRNA作用的相关报道，例如hsa_circRNA_104348可能作为ceRNA通过靶向miR-187-3p/RTKN2轴和激活Wnt/β-catenin通路来促进肝细胞癌进展^[17]，以及circRNA-PTPRM靶向miR-139-5p调控肝癌细胞增殖、迁移和侵袭^[18]。本研究将ncRNA调控与肿瘤代谢通路直接耦合，为解析肝癌代谢重编程的分子网络提供新路径。在转化应用潜力方面，本研究发现，circFBLIM1/miR-338/PFKL轴或可成为肝癌治疗的新靶点。针对糖酵解的干预策略多集中于直接抑制PFKL活性^[19-20]，而本研究提出通过调控上游ncRNA间接靶向PFKL，有望减少药物对正常细胞代谢的不良反应。此外，circRNA具有稳定性高和细胞特异性表达的优势，或可作为肝癌诊断的新型生物标志物^[21]。

本研究存在一定的局限性：仅在体外细胞水平验证circFBLIM1功能，缺乏动物模型和临床样本的验证；circFBLIM1与miR-338/PFKL的调控关系是否受其他信号通路影响，仍需进一步探索。未来研究可结合体内实验和单细胞测序技术，深入解析circFBLIM1在肝癌微环境中的作用机制。

综上所述，本研究揭示circFBLIM1通过miR-338/PFKL轴调控肝癌细胞糖酵解代谢的新机制，为靶向circRNA干预肝癌进展提供理论依据与潜在策略。

利益冲突   所有作者声明无利益冲突