甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺癌最常见的组织学亚型，占甲状腺癌的90%以上^[1-2]。PTC多数属于高分化肿瘤，总体预后良好，但仍有少部分PTC极具侵袭性，在极早期阶段就出现腺外侵犯和淋巴结转移^[3-5]，严重影响患者的手术治疗效果和预后。因此，PTC侵袭性的早期鉴别，对其治疗效果起着关键性作用。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类进化高度保守的单链非编码小分子RNA，其表达失调与多种疾病的发生和发展密切相关^[6-7]。在PTC组织中，关于miRNA的异常表达已有相关研究报道，而外周循环与组织miRNA的表达情况是否一致，目前相关研究较少。有研究发现，在PTC组织中，miRNA-126表达下调，miRNA-613的表达上调^[8-9]。本研究通过检测良性甲状腺肿瘤、侵袭性PTC和非侵袭性PTC患者组织及血浆中的miRNA-126和miRNA-613相对表达水平，分析其表达情况与临床资料的关系，探讨其在PTC的早期临床诊断及预后判断价值，并期望为未来PTC靶向药物研究提供理论靶点。

1 资料与方法 1.1 一般资料

收集2017年8月至2018年12月于锦州医科大学国药东风总医院乳腺甲状腺外科行手术治疗的甲状腺肿瘤患者术前血浆标本和术中组织标本，记录患者临床资料（性别、年龄、肿瘤最大径、肿瘤数量、被膜侵犯、微血管浸润、淋巴结转移、远处转移、病理类型和TNM分期），排除含有以下疾病之一的病例：其他恶性肿瘤、冠心病、2型糖尿病以及PTC以外的其他病理类型甲状腺癌。

所有患者中良性甲状腺肿瘤64例，PTC 72例。良性甲状腺肿瘤患者中，男性21例，女性43例；年龄22~78岁，（41±12）岁；组织标本包含良性甲状腺肿瘤组（n =64）和对应的良性肿瘤瘤旁组（n =64）。PTC组中，男性18例，女性54例；年龄12~82岁，（42±15）岁；其中微小癌45例，多灶癌26例，甲状腺被膜侵犯21例，微脉管侵犯19例，腺外侵犯16例，颈淋巴结转移27例；组织标本包含PTC组（n =72）和对应的PTC瘤旁组（n =72）。PTC组中包含非侵袭性PTC组（n =44）和侵袭性PTC组（n =28）。非侵袭性PTC组中，男性10例，女性34例，年龄16~82岁，（44±16）岁；侵袭性PTC组中，男性8例，女性20例，年龄12~65岁，（39±13）岁。所有病例均为甲状腺肿瘤初次行手术治疗的病例，且术前未行任何抗甲状腺肿瘤的治疗。

1.2 实验方法 1.2.1 血浆标本采集与保存

采集患者清晨空腹外周静脉血（EDTA抗凝管2 mL），4℃静置60 min，室温离心（2 000 r/min，5 min），收集上清于1.5 mL离心管中，4℃离心（2 100 r/min，5 min），将离心后的血浆编号并分装于新的1.5 mL离心管中，每管250 μL，分别加入750 μL TRI Reagent BD（Molecular Research Center，美国），充分颠倒混匀后-80℃超低温冰箱保存。

1.2.2 组织标本收集与保存

收集术中离体组织标本，包括瘤体组织标本和瘤旁组织标本，将组织编号分别置于无酶冻存管，并迅速置于液氮中冻存。

1.2.3 总RNA提取及反转录

采用TRIzol法提取血浆总RNA及组织总RNA（每份组织标本取样量100 mg），用核酸蛋白测定仪（eppendorf BioPhotometer D30，德国）测定总RNA浓度及波长260 nm/280 nm处比值。所提取的总RNA随即按反转录试剂盒miRNA cDNA synthesis kit（Applied Biological Materials，加拿大）的说明，在Gene Touch Plus（博日，杭州）上行反转录，反转录所得cDNA用无RNA酶水稀释10倍，分装后-20℃保存。

1.2.4 PCR扩增

按PCR试剂盒BrightGreen 2X qPCR MasterMix-ROX（Applied Biological Materials，加拿大）的说明，配制20 μ L反应体系，在荧光定量PCR仪（宏石SLAN-48P，上海）上进行PCR扩增。以U6 RNA为内参，引物购自加拿大Applied Biological Materials公司。has-miRNA-126正向引物为5 ’ -CATTATTACTTTTGGTACGC-3 ’，反向引物为5 ’ -CATTATTACTTTTGGTACGC-3 ’；has-miRNA-613正向引物为5 ’ -ACACTCCAGCTGGGAGGAATG TTCCTTC-3 ’，反向引物为5 ’ -TGGTGTCGTGGAGTCG-3 ’；U6 RNA正向引物为5 ’ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ’，反向引物为5 ’ -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ’。反应条件为：95℃活化反应酶10 min；95℃变性15 s，60℃退火/延伸60 s，共40个循环。每个样本设置3个复孔，每批设置3个空白对照孔。各目的基因的相对表达量（relative expression，RQ）采用2^{-△△ ct}方法计算，以U6 RNA为参照。每个样本及对照组的CT值取各复孔的均值。按照△CT＝CT_miRNA-CT_{U6 RNA}计算试验组和对照组的△CT。△△CT＝△CT_实验组-△CT_对照组，最终计算各标本microRNA的相对表达量为2^-△△CT。

1.3 统计学分析

应用SPSS20.0统计学软件分析数据。数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 miRNA-126的表达情况

血浆中PTC组与良性甲状腺肿瘤组miRNA-126相对表达水平比较，差异具有统计学意义（P < 0.01）；侵袭性PTC组与非侵袭性PTC组miRNA-126相对表达水平比较，差异具有统计学意义（ P < 0.05，表 1）。组织中，PTC组与PTC瘤旁组、良性甲状腺肿瘤组、良性瘤旁组miRNA-126的相对表达水平比较，差异均具有统计学意义（均P < 0.05），而后三者两两比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）；侵袭性PTC组与非侵袭性PTC组miRNA-126的相对表达水平比较，差异具有统计学意义（ P < 0.01，表 2）。

2.2 miRNA-613的表达情况

血浆中PTC组与良性甲状腺肿瘤组miRNA-613相对表达水平比较，差异具有统计学意义（P < 0.01）；侵袭性PTC组与非侵袭性PTC组miRNA-613相对表达水平比较，差异具有统计学意义（P < 0.01，表 1）。组织中，PTC组与PTC瘤旁组、良性甲状腺肿瘤组、良性瘤旁组miRNA-613的相对表达水平比较，差异均具有统计学意义（均P < 0.05），而后三者两两比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）；侵袭性PTC组与非侵袭性PTC组miRNA-613的相对表达水平比较，差异具有统计学意义（ P < 0.01，表 2）。

2.3 血浆miRNA-126和miRNA-613水平与PTC临床病理特征的关系

在血浆中，miRNA-126和miRNA-613的相对表达情况在肿瘤最大径、甲状腺被膜侵犯、微脉管侵犯、颈部淋巴结转移、甲状腺腺外侵犯和肿瘤TNM分期方面比较，差异均具有统计学意义（均P < 0.05），而在年龄、性别和肿瘤病灶数量方面比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05，表 3）。

2.4 组织miRNA-126和miRNA-613水平与PTC临床病理特征的关系

在组织中，miRNA-126和miRNA-613的相对表达情况在肿瘤最大径、肿瘤病灶数量、甲状腺被膜侵犯、微脉管侵犯、颈部淋巴结转移、甲状腺腺外侵犯和肿瘤TNM分期方面比较，差异均具有统计学意义（均P < 0.05，表 4）。

3 讨论

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一^[1-2]。虽然多数PTC预后良好，但仍有少数PTC具有极强的侵袭性^[10]，当PTC发生远处转移后，5年生存率仅35%~50%^[11]。因此，对PTC的早期诊断与治疗方式的选择显得尤为关键。随着超声技术的发展，甲状腺肿瘤诊断水平以及性质鉴别能力得到提升^[12]，但对于有些特征不典型的肿瘤，仍难以早期鉴别，虽然细针穿刺细胞学检查有助于肿瘤性质的鉴别，但却存在15%~30%的假阴性^[13]。PTC经规范手术治疗，术后选择性辅助放射碘（radioactive iodine，RAI）治疗及常规口服左甲状腺素片行促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）抑制治疗，可有效抑制大部分肿瘤的复发及转移，但对于侵袭性较强的肿瘤进展的抑制，效果并不理想^[14-15]。而PTC复发性肿瘤及转移性肿瘤，二次手术治疗风险升高，且存在更高的并发症发生率^[16-18]。

miRNA是一类进化高度保守的单链非编码小分子RNA，长约18~24个碱基，广泛参与机体正常生理过程，在转录后水平调控基因表达，其表达失调与多种疾病的发生和发展密切相关。研究发现，miRNA-126在PTC的表达低于癌旁正常甲状腺组织，在人类甲状腺癌细胞系TPC-1和HTH83中，miRNA-126的表达水平与肿瘤细胞的侵袭性相关^[8]。miRNA-613在PTC组织中的表达高于癌旁正常甲状腺组织，且与PTC的腺外侵犯存在相关性^[9]。

本研究显示，与甲状腺良性肿瘤、良性肿瘤瘤旁组织及PTC瘤旁组织比较，在PTC组织中，miRNA-126的相对表达水平下调，而miRNA-613的相对表达水平上调，且在循环中的表达趋势与组织中的表达趋势相一致；侵袭性PTC组中，miRNA-126表达水平较非侵袭性PTC组下调，而miRNA-613的表达水平则较非侵袭性PTC组上调。结合临床病例资料分析显示，miRNA-126和miRNA-613的表达失调与肿瘤最大径、甲状腺被膜侵犯、微脉管侵犯、颈部淋巴结转移、甲状腺腺外侵犯和肿瘤TNM分期有关，提示miRNA-126的表达下调及miRNA-613的表达上调与PTC的进展以及侵袭性有关。

综上所述，miRNA-126和miRNA-613在PTC患者血液循环中表达升高，且与组织表达存在一致性，在未来有望成为甲状腺良性肿瘤与PTC鉴别及PTC侵袭性判定的生化指标之一。然而本研究纳入样本量较少，纳入研究的miRNA类别较少，单一的miRNA缺乏对疾病诊断的特异性，仍需要更多的后续研究以及更大样本量的研究，来探索出最佳miRNAs组合，为PTC提供更多的早期诊断和侵袭性判定方法以及更好的预后判定指标。课题组后续将采用新型固态纳米孔技术对更多的miRNA进行筛选及分析，以期探索出对PTC的诊断及侵袭性判定具有特异性的miRNA组合。课题组将继续探索目标miRNA的靶基因及其作用机制，以期为PTC特异性靶向药物研发提供理论靶点。