我国白血病发病率约为（3~4）/10万，以急性髓系白血病最常见。目前，联合化疗、靶向治疗和造血干细胞移植是白血病的主要治疗方法，但患者长期无瘤生存率低，提高生存率是临床亟待解决的问题。基因突变与白血病的预后直接相关^[1]。临床多采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增后一代测序（Sanger测序）或二代测序（next generation sequencing，NGS）技术检测肿瘤基因突变，检测种类有限，精确性不高。全外显子组是致病突变最为集中的区域^[2]，因此在白血病患者骨髓样本中开展全外显子测序（whole exome sequencing，WES），可以一次性检测到目前全部已知的肿瘤基因突变，准确度高。本研究从5例初发白血病患者骨髓中提取单个核细胞DNA，进行全外显子测序并探索患者的体细胞突变及胚系突变。

1 资料与方法 1.1 一般资料

纳入2018年12月1日至2019年1月31日收治于西安交通大学第一附属医院血液内科的初发白血病患者5例作为研究对象。其中男性1例，女性4例，年龄23~73岁，中位年龄45岁。具体临床资料见表 1。

1.2 诊断标准

白血病诊断标准符合张之南等^[3]主编的血液病诊断及疗效标准（第3版）。

1.3 方法 1.3.1 标本获取

每例患者签署骨髓穿刺同意书，在髂后上棘行骨髓穿刺术，获取骨髓液2 mL，置于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管中。以人淋巴细胞分离液收集骨髓单个核细胞，生理盐水洗涤单个核细胞，然后根据博迈德基因技术(北京)有限公司的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA））提取试剂盒说明书提取DNA。

1.3.2 全外显子测序

全外显子测序委托北京海斯特医学检验公司完成，平均测序深度 > 100×。采用超声打断仪（Covaris s2，美国）将基因组DNA随机打断成小片段DNA(180~280 bp)，进行末端修复、磷酸化、加A尾，连接接头，探针杂交、捕获外显子序列，构建DNA测序文库。按照Illumina标准建库方法行3步酶促反应形成样本文库。文库质量检测，上机测序。建库和捕获实验采用Agilent SureSelect Human A11 ExonV5试剂盒。

1.3.3 全外显子组数据处理和生物信息学分析

首先对测序完成后获得的原始数据进行评估，包括图像识别、碱基识别、过滤接头序列和检测可能的样本污染等基本数据处理，然后进行生物信息学分析。

以千人基因数据库中v37版本作为参考基因组，将有效测序数据进行bwa比对，找到单一比对到基因组上数据序列，将其与外显子组区域再比对，随后进行目标区域中单碱基深度分布和覆盖度均一性分析。利用Genome Analysis Toolkit软件对read的碱基质量进行重新校正，使其更接近真实。突变数据库来源包括COSMIC数据库、1000 Genomes和dbSNP等。

1.3.4 致病突变位点Sanger测序

对于发现的突变位点结合文献及软件分析结果，再经一代测序（Sanger测序），进行比对，再次验证突变位点。测序所得致病候选突变位点，通过http://www.ncbi.nih.gov/查询到相应基因的Gene Bank外显子序列，采用Gene Tool软件对每个候选突变区域进行引物设计，引物由生工生物工程股份（上海）有限公司合成。以基因组DNA为模板，扩增目的DNA片段，所得的PCR产物经过纯化及鉴定后，加入Big Dye® Terminator v3.1（ABI）进行PCR扩增并上机测序，与Gene Bank数据库提供的mRNA标准序列比对，进行突变位点鉴定。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件分析数据。5例患者测序结果的突变数、与疾病相关突变数和测序深度进行列表分析。数据采用均数±标准差（x±s）表示，中位水平采用中位数（范围）表示。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 DNA提取

每例患者标本经基因组DNA提取，均成功提取到基因组DNA，Nanodrop检测DNA浓度及纯度（A₂₆₀/A₂₈₀比值），经琼脂糖凝胶电泳鉴定，所获得的基因组DNA样本均质量良好，Qubit对DNA浓度进行精确定量，数量足够完成本研究、留取标本复核及建立组织样本库为后续研究作准备。

2.2 外显子测序结果

序列捕获采用Agilent液相捕获系统，对人的全外显子区域DNA进行高效富集，然后在Illumina HiSeq上进行高通量、高深度测序。目标碱基的平均覆盖深度波动于107.32×~115.43×。测序输出的原始数据与参考数据库中的外显子基因组序列进行比对，得到与致病相关的突变位点序列、化疗药物相关位点和血液肿瘤遗传易感位点。肿瘤相关基因突变位点又包括有明确临床意义、潜在临床意义和意义未明。并对相应结果进行解读。

通过序列比对分析发现，5例患者中4例均有肿瘤相关基因突变（表 2），分别检测出肿瘤相关基因突变位点：TP53和WT1；NPM1和DNMT3A；CEBPA双突变；FLT3和WT1；均有明确的临床意义。所有致病突变经过Sanger测序验证均确实存在于患者基因组。其中DNMT3A和CEBPA双突变经骨髓及口咽拭子同时测序，证实为体细胞突变（表 3）。检测出化疗药物相关位点包括RRM2、NT5C3A、ABCB1、NOS3、CYP2E1、SLC22A12、SLCO1B1和CD33等，证据等级均为3级。血液肿瘤遗传易感位点每例2~3个，依次包括：rs2191566、rs10936599和rs3745274；rs2191566和rs10936599；rs10936599和rs2191566；rs10936599、rs3745274和rs2191566；rs3745274和rs2191566。

3 讨论

白血病是常见的血液肿瘤^[4]。DNA损伤导致的细胞突变是白血病特异的分子生物学标记^[5]，如NPM1突变、FLT3-ITD突变、C-Kit突变、RUNX1(AML1)突变和ASXL1突变等，与预后密切相关。初诊时确定白血病细胞特异性分子标志可以指导治疗方案选择及判断预后，如TP53基因突变出现在急性髓系白血病提示预后较差^[6]，易对化疗耐药，缓解期短，分层到预后不良组，强烈适用异基因外周血造血干细胞移植在内的强化治疗方案。

细胞突变包括体细胞突变和胚系突变，细胞突变遗传易感检测的开展促进不同治疗方法的选择^[7]，优化治疗。常见的血液肿瘤遗传易感基因突变包括CEBPA基因突变、DDX41基因突变和RUNXl基因突变等，健康者具有上述突变易进展至髓系肿瘤，潜伏期长短不一。对于伴胚系易感基因突变的髓系肿瘤，如RUNXl基因胚系突变的急性髓系白血病，若人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）匹配的亲缘健康供者存在RUNX1基因突变，提示供者可能成为造血干细胞移植后受者复发的因素之一，则必须考虑选择无关供者移植^[7]。本研究纳入5例患者，其中4例经全外显子测序发现多种白血病相关基因突变，其中TP53^[8]、NPM1^[9]、DNMT3A^[10-12]、CEBPA双突变^[13]和FLT3^[14]均报道与白血病预后密切相关。CEBPA突变患者行骨髓及口咽拭子全外显子测序证实，突变来源于体细胞突变，而非胚系突变，从而使血缘相关供者成为可能。

急性白血病经诱导治疗获得完全缓解（complete remission，CR）及多次巩固强化治疗后仍有微小残留^[15]，治疗后微小残留的水平为判断治疗反应、危险度分级和指导进一步治疗选择等提供量化指标，是白血病的独立预后因素。目前主要采用流式细胞术和PCR定量来检测残留，如果发病时确定白血病标志性基因突变，如NPM1^[16]，治疗后动态监测突变改变，可以更好地预测早期复发和死亡，更好地指导治疗和判断预后。为微小残留的监测提供另一种检测手段。本研究中4例患者均发现有明确临床意义的疾病相关突变，提示基因突变对于残留病灶的分析有巨大的价值。对1例（患者编号2）缓解期短、治疗效果不佳的患者进行基因突变动态监测提示，DNMT3A突变持续存在，骨髓及口咽拭子正常组织一代测序分析发现，其突变为体细胞突变，为患者提供可靠的遗传咨询，后期顺利行亲缘半相合异基因外周血干细胞移植。

研究显示，白血病中存在大量基因突变^[17]，目前应用于临床的白血病基因突变检测大概60余种，与疾病的发病及预后有关，诊断为白血病的患者骨髓中存在大量白血病细胞，采取骨髓液提取基因组DNA可进行测序分析^[18]，因二代测序经过扩增和纯化，浓度上能达到检测需要的样本量，不受白细胞数目高低的影响，初诊时用骨髓，后续残留监测可以使用外周血替代骨髓，结果是一致的。可靠性较高，创伤少，具有临床应用价值。

传统的Sanger测序法逐一检测现有的致病突变，不能发现新的突变，而二代测序对全外显子进行检测，提高发现新病变的可能。本研究中发现的基因突变，除了常见于白血病的TP53、NPM1、DNMT3A、CEBPA双突变和FLT3突变外，更发现多个化疗药物相关突变位点和血液肿瘤遗传易感位点^[19]，但因证据等级为3级，仅基于单项有显著性的研究，尚需要多项重复性研究及大样本研究为临床提供重要的诊断和治疗依据，目前数据仅供临床参考。

本研究仅对5例初发白血病患者进行骨髓的全外显子测序，2例进行基因突变类别鉴别，1例进行基因突变的随访，高效地检测出致病位点，检测结果提供大量的基因突变信息，监测突变残留情况，有利于指导临床治疗，但本研究样本量小，有待后续进一步扩大样本量验证上述观点，考虑后续可能行异基因造血干细胞移植的患者，确定基因突变是胚系突变或体细胞突变可协助临床治疗方案的调整^[20]，优化治疗。