口腔鳞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，侵袭力较强，极易向颈部淋巴结转移，而且发病率呈上升趋势。肿瘤的发生和发展一般是多因素和多基因共同作用的结果。表观遗传学在肿瘤中的作用逐步受到重视。针对DNA基因启动子甲基化行肿瘤诊断和治疗是近年来的研究热点^[1]。双肾上腺素样激酶1(doublecortin-like kinase 1，DCLK1)是蛋白激酶超家族和doublecortin家族的成员，基因定位于人类染色体13q13。研究发现，DCLK1基因启动子甲基化在结直肠癌、胃癌和胰腺癌等多种肿瘤中异常^[2-4]，与肿瘤的发生和发展密切相关。目前，有关口腔鳞癌中DCLK1蛋白表达以及DCLK1基因启动子甲基化状态的相关研究报道较为少见。本研究通过对DCLK1基因启动子甲基化和DCLK1蛋白表达检测，探讨DCLK1基因启动子甲基化对其蛋白表达影响，分析DCLK1基因启动子甲基化与口腔鳞癌临床病理特征以及患者预后的关系，为口腔鳞癌诊断和治疗的提供一种新思路。

1 资料与方法 1.1 一般资料

选取2011年3月至2014年5月期间本院口腔科手术切除的129例口腔癌组织及对应癌旁组织(距癌组织>0.5 cm)，所有标本均采用4%甲醛固定，常规石蜡包埋，制成连续组织切片(厚度4 μm)，术后经病理检测癌组织均为口腔鳞癌，癌旁组织未发现癌细胞。其中男性76例，女性53例；年龄31~76岁，(55.4±6.7)岁，中位年龄56.1岁；肿瘤直径 < 2 cm 72例，≥2 cm 57例；TNM分期Ⅰ期39例，Ⅱ期30例，Ⅲ期28例，Ⅳ期32例；分化程度为中低分化56例，高分化73例；淋巴结转移65例，未转移64例。所有患者术前未接受放疗和化疗等治疗。患者或家属均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

DNA甲基化试剂盒购自美国Zymo Research公司；组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；WizardDNA Clean-Up System纯化试剂盒购自上海今迈生物公司；兔抗人DCLK1多克隆抗体均购自北京博奥森公司；通用型SP法免疫检测试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；TRIzol试剂盒购于美国Invitrogen公司；引物均由上海生工生物工程技术公司合成；Gene AmP PCR System 2400购自美国Perkin Elmer公司；DYY-7B型电泳仪购于北京市六一仪器厂；TGL16-WS台式高速离心机购于长沙湘仪礼离心机仪器有限公司；UVT-28凝胶成像系统购自德国Herolab公司。

1.3 甲基化特异性PCR检测DCLK1基因启动子甲基化状态 1.3.1 DNA提取

取厚度为4 μm的石蜡连续组织切片3~5片。采用组织基因组DNA提取试剂盒，严格按照说明书操作，利用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度。

1.3.2 DNA的亚硫酸氢钠修饰和纯化^[5]

取2 μg DNA于1.5 mL EP管中，加超纯水至100 μL。加11.12 μL 2 mol/L NaOH至终浓度为0.2 mol/L，37℃水浴15 min。加入60 μL 10 mmol/L对苯二酚和1.04 mL 3 mol/L亚硫酸氢钠，混合均匀。加2滴石蜡油完全覆盖液面。置55℃水浴箱避光孵育15 h。用WizardDNA Clean-Up System纯化试剂盒纯化(按说明书步骤)修饰后的DNA，纯化后加3 mol/L NaOH使其终浓度为0.3 mol/L，室温放置10 min，用10 mol/L NH₄Ac和冰无水乙醇回收沉淀DNA，并重悬于20 μL超纯水中，直接进行PCR。

1.3.3 甲基化特异性PCR及电泳分析

采用甲基化引物(M)和非甲基化引物(U)对亚硫酸氢钠修饰和纯化后的DNA进行扩增。PCR反应体系为2.5 μL PCR缓冲液(10×)、1.5 μL 25 mmol/L MgCl₂、0.5 μL 10 mmol/L dNTP、0.5 mmol/L上、下游引物各1 μL、1 μL 1 U/μL Taq DNA聚合酶、2 μL修饰后的DNA模板和15.5 μL超纯水共25 μL。PCR反应条件为：95℃预变性5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，经40个循环后72℃延伸10 min。其中DCLK1甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物序列如表 1所示。取10 μL PCR反应产物于2%琼脂糖凝胶电泳并摄像。甲基化结果判断：M有特异产物，而U无产物，判断为纯合型甲基化阳性；如果两者都有特异产物，判断为杂合型甲基化阳性；如果U扩展出特异产物，而M无产物，判断为甲基化阴性; 如果两者均无特异产物，说明实验失败，需要重复实验。将纯合型甲基化阳性和杂合型甲基化阳性均记为甲基化阳性。

1.4 RT-PCR检测DCLK1 mRNA表达

采用TRIzol试剂分别提取口腔鳞癌组织和癌旁组织的总RNA，经反转录获得cDNA，以β-actin为内参，进行实时PCR检测。反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃ 1 min，72℃ 30 s，总共进行45个循环。以β-actin为内参，采用2^-ΔΔCt法计算DCLK1 mRNA的相对表达水平。引物序列如表 1所示。

1.5 免疫组织化学检测DCLK1蛋白表达

取术后经石蜡包埋的口腔鳞癌组织和癌旁组织切片，分别将其于二甲苯、无水乙醇及PBS溶液中进行脱蜡处理，3%过氧化氢灭活内源性氧化酶后，取出切片并使用PBS溶液冲洗3次(5 min/次)。使用微波修复法对抗原进行修复，将切片置于pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液中，微波加热至沸腾后进行冷却，重复操作1次后用PBS清洗。清洗后取出切片封闭10 min，加入一抗，4 ℃孵育12 h。孵育后洗涤，先后滴加生物素标记的二抗和辣根酶标记的链酶卵白素，4 ℃各孵育20 min。孵育后再次洗涤，加入DAB显色液染色5 min，之后经冲洗、对比染色、脱水和封固后置于显微镜下进行观察。从每个切片中随机挑选5个高倍视野中并对阳性染色细胞数量进行统计。按染色强度计分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞所占的百分比计分：< 5%为0分，5%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，>75%为4分。取上述2项结果的乘积：≤3分为阴性表达，＞3分为阳性表达。

1.6 随访

对患者进行复查或电话随访，随访时间为3年，末次随访时间截止至2017年6月20日，死亡患者以死亡时间作为随访截止期。观察记录随访期间患者的生存情况。

1.7 统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用成组t检验。计数资料组间比较采用χ²检验。采用Kaplan-Meier法分析生存情况。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 DCLK1基因启动子甲基化检测

口腔鳞癌组织和癌旁组织中DCLK1基因启动子甲基化电泳图如图 1所示。DCLK1基因启动子甲基化在口腔鳞癌组织和癌旁组织中阳性表达率分别为35.7%(46/129)和64.3%(83/129)。与癌旁组织比较，口腔鳞癌组织中DCLK1基因启动子甲基化阳性率下降，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 DCLK1基因启动子甲基化状态与临床病理特征之间的关系

DCLK1基因启动子甲基化状态在口腔鳞癌患者性别、年龄和肿瘤大小方面比较，差异均无统计学意义(均P＞0.05)，在TNM分期、分化程度和淋巴结转移方面比较，差异均具有统计学意义(均P＜0.05，表 2)。

2.3 DCLK1 mRNA和蛋白表达

免疫组织化学结果显示，DCLK1蛋白阳性表达呈黄色或棕黄色，主要定位于细胞质(图 2，表 3)。

2.4 口腔鳞癌组织中DCLK1基因启动子甲基化与DCLK1 mRNA和蛋白表达之间关系

DCLK1启动子甲基化阳性患者DCLK1 mRNA表达水平和蛋白表达阳性率均低于阴性患者[(0.29±0.03) vs(0.56±0.12), t=19.484，P＜0.01；39.1%(18/46) vs 80.7%(67/83)，χ²=22.782，P＜0.01]。经相关性分析显示，DCLK1基因启动子甲基化状态与DCLK1 mRNA和蛋白表达均呈负相关(r=-0.767，P＜0.01;r=-0.671，P＜0.01)。

2.5 DCLK1基因启动子甲基化预后分析

46例DCLK1基因启动子甲基化阳性表达患者3年死亡17例，83例DCLK1基因启动子甲基化阴性表达患者3年死亡47例。Kaplan-Meier分析结果显示，DCLK1基因启动子甲基化阳性表达患者3年无进展生存率(progression free survival，PFS)和3年总生存率(overall survival，OS)均高于阴性表达患者(63.0% vs 43.4%，69.6% vs 47.0%，均P＜0.05，图 3)。

3 讨论

口腔鳞癌是全球最常见癌症之一，具有高侵袭性、高发病率以及高死亡率^[6]。近年来，随着科学技术的发展，虽然口腔鳞癌的治疗技术提高很多，但目前患者生存率依旧很低。因此，早发现、早诊断以及早治疗是提高口腔鳞癌患者生存率的关键。口腔鳞癌的发生和发展过程涉及多个基因的异常表达，表观遗传机制在基因异常表达中发挥重要作用。DNA甲基化是表观遗传学的主要内容之一，可阻止和遏制抑癌基因的转录，使其表达缺失^[7]。基因启动子甲基化可用作口腔鳞癌潜在和敏感的生物学标志物，为其早期诊断和预后情况判断提供一种新思路。

DCLK1被发现于有丝分裂后的神经元中，属于双肾上腺家族，是一种新型的肿瘤干细胞标志物。相关报道表明，DCLK1在多种肿瘤中呈高表达，与肿瘤发展进程息息相关^[8]。Gao等^[9]研究发现，结直肠癌组织中DCLK1 mRNA和蛋白表达均高于正常结直肠组织，其高表达与淋巴转移和预后不良相关。DCLK1上调可能通过激活上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)在结直肠癌转移和预后不良中发挥作用，可作为结直肠癌预后的独立预测因子。Bailey等^[10]研究发现，胰腺导管腺癌组织中DCLK1高表达，DCLK1敲低时肿瘤生长停滞，DCLK1通过调节多种因子和途径在胰腺肿瘤发生中发挥重要作用。孟庆彬等^[11]研究发现，DCKL1在胃癌组织中高表达，并与胃癌淋巴结转移和脉管癌栓相关，是胃癌患者预后不良的一个潜在分子指标。本研究结果表明，口腔鳞癌组织中DCLK1 mRNA和蛋白表达均较癌旁组织增加，提示DCLK1可能作为促癌基因参与口腔鳞癌发生或发展过程，检测其表达水平可能为疾病的临床诊治提供一种新途径或新方法。

DNA甲基化是指在甲基化转移酶的催化下，DNA序列中的腺嘌呤或胞嘧啶碱基与甲基发生共价结合，细胞分裂过程中传递给子细胞的表观遗传现象，其与肿瘤发病的作用机制之间的关系日益受到研究者们的重视^[12]。肿瘤组织DNA甲基化异常主要表现为2种形式，分别为癌基因去甲基化和抑癌基因超甲基化。在肿瘤细胞或组织中，DNA异常甲基化所涉及到的基因在DNA修复、细胞周期调控、信号传导以及肿瘤细胞侵袭、转移等过程中扮演着重要角色^[13]。研究发现，32例肺癌患者中近50%的患者DCLK1启动子甲基化，DCLK1启动子甲基化患者的中位总生存率低于未进行DCLK1基因修饰的患者，DCLK1启动子甲基化可用于评估肺癌病程的早期诊断和预测^[14]。有临床研究显示，DCLK1基因的5′-启动子在结肠癌细胞中高度甲基化能导致DCLK1转录物的表达丧失，DCLK1甲基化可能是治疗结肠癌的重要靶点^[15]。目前，关于口腔鳞癌组织中DCLK1基因启动子甲基化的研究较为少见。本研究结果表明，口腔鳞癌组织中DCLK1基因启动子甲基化阳性表达率比癌旁组织下降，呈现低甲基化状态，并且DCLK1基因启动子甲基化阳性表达与mRNA和蛋白表达均呈负相关(r=-0.767，P＜0.01；r=-0.671，P＜0.01)，提示DCLK1基因启动子低甲基化可能通过上调DCLK1 mRNA表达和增加其蛋白分泌参与口腔鳞癌的发生和发展过程，采用甲基化治疗可使癌基因失活。本研究结果还显示，口腔鳞癌组织中DCLK1基因启动子甲基化状态在患者TNM分期、组织分化程度和淋巴结转移方面比较，差异均具有统计学意义(均P < 0.05)，影响患者预后，提示DCLK1甲基化与口腔鳞癌病理特征及预后密切相关，充分了解DCLK1甲基化在肿瘤发病机制中的作用，对于病情的判断以及预后评估有重要价值。

综上所述，在口腔鳞癌组织中，DCLK1基因启动子甲基化阳性表达率下调，与DCLK1 mRNA和蛋白表达呈负相关，并且DCLK1基因启动子甲基化状态与患者临床病理特征以及预后相关，可能成为效评估肿瘤侵袭或转移的有效指标，为口腔鳞癌的甲基化治疗提供行一种新思路。但本研究还存在一些不足之处，需要进一步在扩大样本量的基础上深入研究DCLK1甲基化在口腔鳞癌中的发病机制。