胆管癌是指原发于左右肝管汇合部至胆总管下端的肝外胆管恶性肿瘤^[1]。其临床症状表现为胆管出血、肝脏损害、胆管感染和黄疸等。因胆管癌发病病因尚未明确，导致患者一旦确诊为胆管癌即已进入疾病进展期，又因患者需解剖的部位和邻近器官的特殊性，手术难度大，根治不易，预后较差。随着胆管癌患者的增多，近几年国内有关肿瘤发生机制的研究也受到越来越多研究学者的重视^[2-3]。随着科技的发展，肿瘤的诊断与治疗也成为研究的热点。细胞表面糖蛋白酶诱导体cluster of differentiation 147(CD147)和基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7，MMP-7)均可表达人体多种组织，高表达多出现于肿瘤细胞中；CD147能诱导基质金属蛋白酶的分泌，MMP-7则主要在肿瘤细胞或肿瘤浸润边缘的间质中表达^[4]。CD147和MMP-7在肿瘤的检测和诊断中起到重要作用^[5]。目前有关CD147和MMP-7表达研究较少。本研究主要分析CD147和MMP-7在胆管癌组织中的表达及其与临床特征的关系。

1 资料与方法 1.1 一般资料

收集2015年4月至2016年4月本院经手术切除胆管癌且经病理证实的109例胆管癌组织标本为胆管癌组，男性95例，女性14例；年龄32~58岁，中位年龄49岁。另取同期经胆管癌根治手术治疗的100例患者癌旁正常胆管组织标本为对照组，男性87例，女性13例；年龄33~56岁，中位年龄48岁。两组患者在年龄和性别等一般资料方面比较，差异均无统计学意义(均P＞0.05)，具有可比性。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：(1)年龄30~70岁；(2)胆管癌诊断标准^[6]；(3)没有其他重大心脏类疾病；(4)知情并同意参与本研究。排除标准：(1)合并患有其他肿瘤患者；(2)有精神病史；(3)术前进行过肿瘤治疗。

1.3 检测方法

所有患者均采用Image-pro Plus 6.0图像分析^[7]和免疫组织化学法检测CD147和MMP-7在胆管癌和癌旁胆管组织中的表达。

1.3.1 主要试剂及实验仪器

鼠抗人CD147、鼠抗人MMP-7单克隆抗体、DAB显色剂和免疫组织化学试剂盒采购于北京中杉金桥生物技术公司。主要仪器包括北京佳源兴业科技有限公司YD-1508R型病理切片机和日本奥林巴斯OLYMPUS光学显微镜等。

1.3.2 SP免疫组织化学染色

将石蜡切成片并脱蜡10 min，共3次，然后放入不同浓度乙醇均保留l min。先后采用蒸馏水和磷酸盐缓冲液各清洗5 min。浸于0.01 mol/L pH 6.0枸椽酸盐酸缓冲液内，在微波炉中高温加热至修复液沸腾，调至中火保持沸腾5 min。修复后切片在修复液中冷却至室温(MMP-7不进行抗原修复，直接进入下一步)。采用PBS冲洗后滴加3%过氧化氢阻断试剂，室温下孵育10~15 min。之后继续使用PBS冲洗，完成后放在保湿盒中，将其置于4℃冰箱过夜孵育。将一抗孵育后的切片用PBS清洗，滴加二抗山羊抗鼠IgG(H+L)抗体，室温下60 min。使用PBS清洗后将DAB显色剂以1 :20稀释于DAB底物缓冲液，每张切片上滴加新鲜配制的DAB 50 μL。显色后，切片置于自来水中，冲洗10 min，再经蒸馏水洗，对比染色1 min，乙醇盐酸分化，自来水冲洗，氨水返蓝30 s，再自来水冲洗至满意为止。经乙醇脱水，各乙醇浓度分别保留1 min。再置于100%三级二甲苯透明，每次5 min，共3次，中性树胶封固。

1.4 观察与评价标准

对CD147和MMP-7的染色切片拍取不同视野，并对每个视野采用Image-pro plus 6.0图像分析软件进行分析，在测量CD147和MMP-7表达时，染色图片的表达使用阳性单位(positive unit，PU)^[8]作为代表。对各个标本CD147和MMP-7的PU值进行检测和计算，依次统计分析其在胆管癌组和对照组的表达情况，PU值=(G_a-G_A)/AA_β×G_max(G_a：待测阳性产物a的灰度值；G_A：A区域的灰度值；AA_β：β在A区的密度；G_max：系统最大灰度分级)。根据灰度图像把PU值分为0~100个等级，代表免疫组织化学反应程度，并排除切片与涂片本底因素干扰。

免疫组织化学法判别标准：染色强度评分标准为黄褐色3分，棕黄色2分，黄色1分，不着色0分；阳性细胞所占比例评分标准采用0~4分级别评分法，阳性细胞数≥70%为3分，40%≤阳性细胞数＜70%为2分，10%≤阳性细胞数＜40%为1分，阳性细胞数 < 10%为0分；上述2种评分相加0~2分为弱表达，3~6分为强表达。

1.5 统计学分析

使用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计量资料使用均数±标准差(x±s)，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 CD147和MMP-7的表达

胆管癌组CD147和MMP-7的PU值均高于对照组，差异均具有统计学意义[(33.9±9.4)PU vs (12.3±4.3)PU，(57.5±15.4)PU vs (12.2±2.5)PU，均P < 0.01]。免疫组织化学检查显示，CD147在胆管癌细胞核或间质呈低表达，在细胞膜或细胞质中呈高表达；MMP-7在胆管癌细胞核或间质呈现无表达或低表达，在细胞质中呈高表达(图 1)。

2.2 MMP-7和CD147表达与胆管癌临床病理特征的关系

MMP-7和CD147表达在胆管癌患者的性别、年龄和有无神经侵犯方面比较，差异均无统计学意义(均P＞0.05)，而MMP-7和CD147表达在浸润深度、病理分化程度及TNM分期方面比较，差异均具有统计学意义(均P＜0.05，表 1)。

3 讨论

胆管癌属于消化系统内常见的恶性肿瘤，多发于50~70岁，且以男性为主。目前胆管癌的病因尚不明确，胆管癌发生的基础是因感染影响产生的慢性炎性反应及胆管慢性炎性反应的刺激。而近年来有研究显示，胆管癌的发生与丙型肝炎及乙型肝炎也可能存在一定的关系^[9]。据肿瘤的生长部位，可将胆管癌分为下段、中段和上段胆管癌。其病理形态可分为乳头状癌、弥漫性癌及结节状癌^[10]。基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-2等均可由CD147在体外诱导成纤维细胞合成。通过对肿瘤和CD147更进一步的研究发现，CD147在多种恶性肿瘤中均高表达^[11]。CD147参与促进乳腺癌肿瘤细胞的生长、浸润及转移。MMP-7在乳腺癌、前列腺癌及肺癌等肿瘤中也呈高表达，能促进肿瘤细胞及肿瘤血管的生长及生成，在一定程度上可促进肿瘤细胞的浸润及转移。MMP-7的表达在恶性肿瘤中随着浸润深度的增加而增加^[12]。

本研究结果显示，胆管癌组织中表达CD147和MMP-7。其表达在患者浸润深度、病理分化程度及TNM分期方面比较，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)，且趋势相同，提示CD147和MMP-7之间存在着某种关联。本研究结果表明, CD147和MMP-7的表达与肿瘤的发生、发展和预后均有相关。联合CD147和MMP-7的检测对胆管癌患者早期诊断、治疗及预后可能具有较高的临床价值。