余甘子(Phyllanthus emblica L.)系大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属(Phyllanthus)多年生灌木或小乔木^[1], 原产于中国、印度、泰国、马来西亚等热带和亚热带的国家和地区，其中以中国和印度分布面积最大，产量最多^[2]。我国余甘子主要分布在福建、广东、广西、云南、海南、台湾等地^[3]，其中福建产量最多。余甘子是一种极具开发潜力的高产、优质经济树种^[4]，不仅是水土保持、荒山绿化的优良树种，又是联合国推荐种植的3种保健树种之一^[5]。余甘子的果实一般用于鲜食和药用，约有17个国家将其视为传统药物，我国约有16个民族的药物体系中使用该果实，历版《中华人民共和国药典》均有收录^[6]。我国是余甘子的原产国，种质资源储有量丰富，但90%以上处于野生或半野生状态，福建除拥有丰富的野生种质资源外，良种栽培面积全国最大。目前余甘子的品种(系)命名繁杂，存在同名异种、同种异名的现象，影响种质资源收集、保存和育种工作的正常进行，及时摸清不同种质间的亲缘遗传关系，对育种父母本的正确选择，获得相应的育种目标有重要意义。

简单重复序列区间(inter-simple sequence repeats，ISSR)标记由ZIETKIEWICZ et al^[7]1994年提出，与其它分子标记相比，具有操作简便、高效、成本低、无需明确任何靶标序列且稳定性好等优点，已被广泛地应用在多种作物上。但以余甘子种质资源为试材尚未充分研究，刘晓生等^[8]与周春娟等^[9]分别对广东潮汕和粤东地区余甘子种质资源进行ISSR分子标记分析；邵雪花等^[10]对中国华南地区28份种质进行遗传多样性分析并构建遗传指纹图谱；李巧明等^[11]对云南干热河谷地区的4个余甘子居群进行遗传多样性研究，而综合国内外余甘子种质资源利用ISSR分子标记技术开展亲缘关系分析还未见报道。本研究以ISSR通用引物分析国内外38份余甘子种质资源和1份近缘种(Phyllanthus reticulatus Poir.)的遗传多样性，鉴定种间的亲缘关系，为余甘子种质资源的精准鉴定评价和育种亲本选择提供理论基础。

2019年10月, 采集余甘子种质资源的健康嫩叶，于-80 ℃保存备用。健康嫩叶由国家热带植物种质资源库-余甘子种质资源分库提供，其位于福建省福州市晋安区新店镇埔垱村(119°19′59″E，26°07′48″N，海拔20 m)。种质名称及来源见表 1。

主要试剂：2×Taq Master Mix(由dNTP混合物、Taq DNA聚合酶和MgCl₂混合而成)购自天根生化科技(北京)有限公司，所用引物为不列颠哥伦比亚大学(University of British Columbia，UBC)公布的100条ISSR通用引物，编号为UBC801~900，由北京六合华大基因科技有限公司合成。主要仪器设备：离心机(SIGMA 1-14K，希格玛公司，德国)、电泳仪(BIO-RAD Power Pac Universal，伯乐公司，美国)、电泳凝胶成像仪(BIO-RAD Gel DOCTMXR⁺，伯乐公司，美国)、超微量核酸测定仪(Thermo NanoDrop One，赛默飞世尔科技有限公司，美国)、移液器(Eppendorf Research Plus，艾本德公司，德国)和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(BIO-RADT100TM，伯乐公司，美国)等。

提取余甘子基因组DNA采用李金璐等^[12]改良的十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)方法，经微量紫外分光光度计测得样品DNA的浓度为100~200 ng·μL^-1，A260/A280比值介于1.83~2.14之间；利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品，将完整性较好、纯度较高的样品DNA稀释浓度为30 ng·μL^-1于-80 ℃保存。部分DNA提取电泳效果见图 1。

	注：M为15 000 bp DNA Maker；1、9、13、19、30为种质编号。Note: the numbers above the lanes denote germplasms, which correspond to those shown in Table 1. 图 1 部分余甘子种质资源DNA提取电泳效果 Fig. 1 Electrophoresis of the DNA of selected Phyllanthus emblica varieties
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ISSR反应体系总体积25 μL，包含引物(UBC 841)2 μL、2×Taq Master Mix添加量13 μL、DNA模板1 μL，RNase-Free water 9 μL；扩增条件：预变性94 ℃，5 min；变性，94 ℃，45 s；退火温度52.5 ℃, 45 s；延伸72 ℃，2 min；35个循环；终延伸72 ℃, 6 min；最后于4 ℃保存。扩增完成后，取2 μL扩增产物染色点样于1%琼脂糖凝胶上，加0.5×TEB缓冲液，在120 V电场强度下电泳30 min，于凝胶成像仪上观察拍照。

选用地域差异较大的缅甸、印度、广东、云南、福建5份余甘子种质资源的DNA组成混合的DNA为模板筛选引物，以UBC801~900共100条ISSR通用引物应用1.2.2反应条件进行PCR扩增，筛选出条带清晰，多态性好的引物为余甘子的ISSR适用引物。利用筛选出的引物对38份余甘子种质资源和1份近缘种的样品DNA以1.2.2反应条件进行PCR扩增，研究余甘子种质资源遗传多样性与亲缘关系。

根据扩增谱带照片，将清晰、可重复且长度在200~2 000 bp的条带进行记录，对同一引物的扩增条带，迁移率相同的条带计1个位点，扩增阳性(有条带)记为“1”，扩增阴性(无条带)记为“0”，所得数据输入Excel表格，建成原始表征0~1数据矩阵。利用NTSYS 2.1软件对数据进行分析，计算品种间的相似系数，并进行非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA)遗传相似度聚类分析，绘制39份供试材料的遗传聚类图，鉴定品种间的亲缘关系。

以具有3条或3条以上清晰条带作为多态性较好标准，100条UBC通用引物共筛选出17条电泳条带清晰、多态性良好的可作为余甘子的ISSR分子标记的适用引物，引物序列见表 2。17条引物共获得136条带，其中多态性条带126条，多态百分率为92.65%，表明余甘子种质资源遗传多样性丰富，不同个体间有较大遗传差异。不同引物扩增条带数不等，条带范围为5(UBC 852)~11(UBC 809和UBC 851)条之间，引物UBC 841对39份供试材料的扩增结果如图 2所示。

	注：M为2 000 DNA Maker；1~39为种质编号。Note: lanes labeled 1 to 39 correspond to the germplasms numbered 1 to 39 in Table 1. 图 2 引物UBC 841的凝胶电泳结果 Fig. 2 Electrophoresis of Phyllanthus varieties amplified using the primer UBC841
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	图 3 基于ISSR分子标记技术的39份试材的聚类分析 Fig. 3 Dendrogram of the 39 assessed germplasm resources based on ISSR marker analysis
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根据供试材料两两种质间的遗传相似系数可知，39份研究材料遗传相似系数的范围为0.380~0.925，其中，泰国近缘种与其他种质资源相似系数为0.380~0.590；其余38份余甘子种质资源遗传相似系数范围为0.537~0.925，最低遗传相似系数为泰国野生01与广东省的‘甜种品系01’(遗传相似系数=0.537)；最高为福建‘秋白’与‘兰丰02’，遗传相似系数达0.925，两份种质是否为同种异名可结合种质表型等相关数据做进一步研究。福建地区15份余甘子种质资源间的遗传相似系数为0.648~0.925，广东地区9份余甘子种质资源的遗传相似系数为0.648~0.870，表现丰富的遗传多样性；分布于福建、广东及云南的余甘子种质资源遗传多样性均处于较高水平。采用UPGMA方法进行聚类，得到39份供试材料的亲缘关系聚类图谱(图 3)。在遗传相似系数为0.670处，可将除泰国近缘种外的38份资源分为3种类型，分别为粤缅类型种质(编号1~5，9~16)、滇泰类型种质(编号7~8，19~23)和闽南类型(编号25~39)，聚类结果表现出一定的地理区域特性，福建地区种质丰富，表现丰富的遗传多样性，单独聚为一个类型，从种质表型上分析同样与云南、缅甸、泰国等种质差异较大。

在遗传相似系数为0.715处，可将39份供试材料分为8种类型: 第1类为缅甸种(编号1~5);第2类为广东种(编号9~18)，其中珍珠品系与甜种亲缘关系较近, 聚类树状图表明第2类印度大果(编号9)与广东种珍珠品系(编号10~15)亲缘关系较近，该类种质果实大且具有较好鲜食品质，可能因引进境外种质用于良种繁育，存在遗传杂交；第3类为‘珍珠品系05’(编号15)单独聚为一类，与其余广东珍珠品系亲缘关系较远；第4类为泰国野生种质(编号7~8)；第5类为云南种质(编号19~23)，其中‘盈玉’品种(系)(编号19)果实大且有较好商品性，与印度大果(编号9)亲缘关系较远；第6类为福建种质(编号24，26~34，38~39，35~37，)，其中‘兰丰01’(编号27)与‘兰丰02’(编号29)亲缘关系较远，存在同名异种的情况；第7类为福建种质‘山甘’(编号25)单独聚为一类，因福建省地区“八山一水一分田”的独特地理环境因素，种质之间巨大的局部地理环境差异导致地理隔离，故同一地区存在亲缘关系较远情况；第8类为来源泰国的近缘种(编号6)，在遗传相似系数为0.503时与余甘子种质资源聚为一类。

目前，ISSR已广泛用于植物品种鉴定、遗传多样性、亲缘关系、和分子生态学研究等诸多领域^[13-14]。本研究从UBC100条通用引物中筛选出17条多态性高，清晰、稳定性好的引物用于PCR扩增，对38份余甘子种质资源和1份近缘种材料进行遗传多样性和亲缘关系分析，共获得多态性条带126条，多态百分率达92.65%，表明余甘子种质资源具有较高的遗传多样性，且高于李巧明等^[11]对云南地区和刘晓生等^[8]对潮汕地区余甘子种质资源的遗传多样性研究结果。亲缘关系分析将39份不同来源种质资源区分归类，揭示了不同品种间的相互关系，并体现了较好的多态性，ISSR分子标记技术是鉴定余甘子种质资源亲缘关系的一条有效途径。

通过对国内外38份余甘子种质资源和1份近缘种进行遗传相似系数与聚类分析，38份余甘子种质资源遗传相似系数范围为0.537~0.925，福建、广东、云南3个余甘子主栽省份均表现丰富的遗传多样性，与郭林榕^[15]、蔡英卿等^[16]、赵琼玲等^[17]的研究结果一致。从聚类结果看，地域来源相近，生境相似地区的种质资源遗传关系较近，遗传聚类图谱将其划分为一组，具有明显的地域分布规律。福建地区多山川河流，气候复杂，存在因长期地理隔离导致的生殖隔离。云南地区的野生余甘子种质资源分别散落在两个不同组内，表明其遗传多样性较高，存在种质共享交流。缅甸与广东虽然地理位置相隔较远，但两个地区的余甘子种质资源在遗传相似系数为0.670时聚为一类，这可能与两地区生态环境较为相似或存在两地间品种交流有关，还需进一步研究。在遗传相似系数为0.715处，可将39份供试材料分为8种类型: 第1类为缅甸种; 第2类为广东种; 第3类为广东‘珍珠品系05’; 第4类为泰国野生种质; 第5类为云南种质; 第6类为福建种质; 第7类为福建种质‘山甘’; 第8类为来源泰国的近缘种。余甘子种质资源遗传多样性水平高，并表现出明显的地理区域特性。在分子层面将疑似同名异种的‘兰丰01’与‘兰丰02’两份种质区分，筛选出‘山甘’与整个福建地区种质遗传亲缘关系较远，单独聚为一类，在遗传相似系数为0.715处分类可较好区分不同种质间的亲缘关系。此外，广东与福建地区为率先开展良种繁育与标准化栽培的地区，其中福建地区栽培面积最大，由于良种繁育和销售等多种因素的影响，造成大量品种同名异种或异名同种情况，从亲缘关系的研究着手可有效消除种质名称干扰，对余甘子种质资源保护和品种繁育的规范化发展有重要意义。

研究表明，区域种群间的遗传分化受地理、生态环境等因素的影响^[18]，余甘子种质资源群体间的遗传分化水平较高，保护和利用优良个体或区域品种群的基因资源对培育或改良品种具有一定意义。目前，余甘子资源缺乏全面的整理和发掘，我国各个地区品种类型虽多，基本上属于高度混杂的实生群体，现如今由于城市扩张，土地遭到大面积开发，余甘子野生种质资源遭受严重破坏，生存和繁育受到很大威胁，亟需加强余甘子种质资源的保护、利用和更新。