花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)是我国重要的木本调料、香料和油料树种，具有极强的抗旱、耐瘠薄能力，是干旱、瘠薄山丘最适宜的生态经济树种之一，并因其富含芳香油和麻味素而闻名^[1]。我国花椒年产量约12×10⁴ t，且每年以20%~30%的速度递增，总面积和产量均居世界前列^[2]，这对加快山区群众脱贫致富，实现乡村振兴具有重要意义。

山东省现有花椒种植面积约3×10⁴ hm²，年平均产量3.5×10⁴ t，产值约30亿元，而山东省泰安市种植的花椒常遭受霜冻危害，造成大面积减产或绝收，对泰安市的花椒产业发展带来严重威胁，气候因素已成为制约花椒产业发展的限制性因素之一^[3]。泰安市花椒种植面积逐渐扩大和抵抗低温冻害的经验不足，导致花椒因花芽受冻害而减产问题日趋严重^[4]。因此，亟需建立快速、准确、经济的花椒抗寒评价体系，筛选出抗寒花椒品种。有研究表明，在人工模拟匀速降温环境中更适于评价刺桐姬小蜂(Quadrastichus erythrinae Kim)的低温耐受性^[5]；模糊隶属函数法也被广泛地应用于樟[Cinnamomum camphora (L.) J. Presl]、石榴(Punica granatum L.)的抗寒性研究中^[6-7]。植物本身对低温的适应是一个复杂变化的生理生化调节过程，靠单一指标很难系统地了解植物的抗逆本质。有研究表明，植物组织电解质渗出率为50%时的温度作为半致死温度(semi-lethal temperature, LT₅₀)，此时Logistic方程拟合的可靠性较高^[8]。鉴于此，以山东省泰安市栽植的‘狮子头’(Z. bungeanum ‘Shizitou’)、‘莱芜少刺’(Z. bungeanum ‘Laiwushaoci’)和‘凤椒’(Z. bungeanum ‘Fengjiao’)3个主栽花椒品种的枝、叶为研究对象，人工模拟梯度低温胁迫二级枝当年生顶梢枝、叶，测定花椒枝、叶的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化物酶(peroxidase, POD)活性，并测定丙二醛(malonaldehyde, MDA)、可溶性糖、脯氨酸(proline, Pro)、可溶性蛋白、叶绿素(chlorophyll, Chl)含量及相对电导率(relative electrical conductivity, REC)等生理生化指标，利用隶属函数法评价不同花椒品种的抗寒性，以期阐明不同品种花椒对低温的耐受能力，选出抗寒能力较强的优良品种，为花椒抗寒良种选育和引种提供理论依据。

试验地位于山东农业大学林学试验站(36°11′N，117°08′E)，海拔150 m，属于温带季风气候，年平均气温13.0 ℃，极端最高气温42.1 ℃，极端最低气温-20.7 ℃，平均霜期209 d，年平均光照时间2 290~2 890 h，年平均降水量550~950 mm，全年降水量有60%~70%集中在夏季。春季、晚秋及冬季易发生冻害。

供试材料为‘莱芜少刺’、‘狮子头’和‘凤椒’的3年生优良花椒苗木，2017年4月, 定植于山东农业大学林学试验站。2020年4月17日下午(17∶00—18∶00)，选取树龄相同、长势相近、管理条件一致、健康无病虫害的母树3株，在母树上剪取20 cm充分成熟、粗度相近且叶片均匀完整的二级枝当年生顶梢枝条，迅速带回室内，在高低温湿热培养箱(型号BAGW-100, 无锡博奥试验设备有限公司)内进行模拟低温胁迫处理。为统一测定低温后花椒叶片的生理生化指标，试验以低温4 ℃为对照，以2 ℃的梯度缓慢降温，设置2、0、-2和-4 ℃温度处理，每个品种花椒在不同低温胁迫下均处理3个枝条。为避免瞬间降温过快，使植物产生应激性，试验在室温条件下以小于4 ℃·h^-1的速度降温，直至试验温度。胁迫12 h后，以相同的升温速度升至室温，枝条底部切口插入蒸馏水中复水24 h，剪取部位相同(羽状复叶尖端向下的第5、6叶)的叶片和枝条用于生理生化指标测定。

称取0.5 g(鲜质量)样品放入研钵内，加入50 mmol·L^-1磷酸缓冲液[内含质量分数2%的聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)；pH值7.8]5 mL，在冰浴下研磨成浆，匀浆移入离心管内，置于离心半径10 cm、4 ℃、10 000 r·min^-1的台式高速冷冻离心机(型号H2-16K-II, 湖南可成仪器设备有限公司)离心20 min，上清液用于测定SOD、POD活性、MDA和可溶性蛋白质含量。

SOD活性测定采用氮蓝四唑(nitroblue tetrazolium, NBT)光还原法，POD活性测定采用愈创木酚法，MDA含量测定采用三氯乙酸-硫代巴比妥酸(trichloroacetic acid-thiobarbituric acid, TCA-TBA)法，Pro含量测定采用茚三酮显色法，可溶性糖含量测定采用蒽酮法，可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法，Chl含量测定采用乙醇提取法^[9]。REC采用电导率仪(型号DDSJ-308A, 上海雷磁设备厂)测定，计算低温胁迫下花椒的LT₅₀。经不同温度低温处理后，重复测定3次。

用隶属函数法综合评价抗寒性，公式如下：

式中：f(X_i)表示各主因子的隶属函数值，X_i表示各品种第i个综合指标值，X_max和X_min分别为各花椒品种第i个综合指标值的最大值和最小值。当某一指标与抗寒系数成负相关关系时，用公式(2)计算隶属函数值^[10]。

不同低温胁迫后，花椒叶片保护酶活性的变化明显，结果如图 1所示。从图 1(a)可知，不同品种花椒叶片的SOD活性均在-2 ℃时达到峰值，SOD活性大小为‘莱芜少刺’＞‘凤椒’＞‘狮子头’。在4~2 ℃的低温胁迫下，‘凤椒’叶片的SOD活性缓慢升高；‘狮子头’和‘莱芜少刺’则呈下降趋势，这可能与不同品种对低温胁迫的反应程度不同有关。在2~-2 ℃低温胁迫下，不同品种花椒叶片的SOD活性均明显升高，而在-2~-4 ℃时急速下降。在4~-2 ℃初期低温胁迫过程中，‘凤椒’叶片的SOD酶活性呈增加趋势，这表明其SOD酶活性在低温胁迫下比‘狮子头’及‘莱芜少刺’更为敏感。在2~-2 ℃低温胁迫中，‘莱芜少刺’SOD活性增幅为592.72%，‘狮子头’和‘凤椒’分别为873.65%、290.71%。3个品种花椒叶片于4~-4 ℃低温胁迫后POD活性变化如图 1(b)所示。不同品种花椒叶片的POD活性均在2~-2 ℃低温胁迫时升高，且‘莱芜少刺’最高至4 210 U·g^-1，但在-2~-4 ℃低温胁迫时，3个花椒品种的POD活性均下降。

	图 1 不同低温胁迫后花椒叶片保护酶活性的变化 Fig. 1 Protective enzyme activity responses in Z. bungeanum leaves under low temperature stress
图选项

MDA是膜脂过氧化的最终产物，是判断植物受损伤程度的重要指标之一，低温胁迫会加剧膜脂过氧化的程度。不同低温胁迫后花椒叶片丙二醛含量的变化如图 2所示，随低温胁迫逐渐加重，不同品种花椒叶片的MDA含量均发生明显变化。4~2 ℃低温胁迫时，‘狮子头’和‘莱芜少刺’叶片的MDA含量升高较快，分别比对照升高46.22%、71.53%，而‘凤椒’叶片的MDA含量变化较小。2~-2 ℃降温过程中，不同品种花椒叶片的MDA含量均降低，这是由于保护酶活性增强后对植物的保护机能显现；当温度降低为-2~-4 ℃时，保护酶活性降低，膜脂过氧化作用增强，即MDA含量升高。

	图 2 不同低温胁迫后花椒叶片丙二醛含量的变化 Fig. 2 Malondialdehyde content changes in leaves of Z. bungeanum under low temperature stress
图选项

植物受低温影响，细胞内的原生质膜透性会增大，离子外渗，导致REC升高。不同低温胁迫后花椒相对电导率的变化如图 3所示，随着低温胁迫加重，不同品种花椒的REC均有升高趋势，但升高的幅度差异较大。从图 3(a)可以看出，对照处理时，‘凤椒’叶片的REC最低，但其在4~2 ℃的降温过程中迅速升高，表明此时低温胁迫使叶片损害。在-4 ℃胁迫时，不同品种花椒叶片的REC均达到最高值，叶片细胞质外渗严重。从图 3(b)可以看出，在-4 ℃低温胁迫时，‘凤椒’枝条的REC达到70.36%，且其在不同低温胁迫下的REC均高于其余品种。在4~0 ℃低温胁迫下，‘狮子头’和‘莱芜少刺’枝条的REC基本保持平行上升的关系；在0~-2 ℃低温胁迫下，‘莱芜少刺’枝条的REC迅速升高并超过‘狮子头’，表明此时‘莱芜少刺’的枝条细胞受损伤程度迅速加重。Logistic方程拟合结果(表 1)表明，不同品种花椒的半致死温度由低到高为‘莱芜少刺’、‘狮子头’、‘凤椒’。

	图 3 不同低温胁迫后花椒相对电导率的变化 Fig. 3 Changes in leaf and branch relative electrical conductivity of Z. bungeanum after low temperature stress
图选项

相关性分析结果表明(表 2)，温度与花椒叶片和枝条的REC均呈极显著负相关关系(P < 0.01)，POD与SOD呈极显著正相关关系(P < 0.01)，可见SOD与POD在对低温胁迫防御方面存在共一性，都对低温胁迫做出积极的防御。MDA含量与SOD活性呈显著负相关关系(P < 0.05)，与温度、Chl含量均呈极显著负相关关系(P < 0.01)，但与可溶性糖含量有极显著正相关关系(P < 0.01)，与Pro含量呈显著正相关关系(P < 0.05)。

不同品种花椒叶片在低温胁迫后渗透调节物质含量变化如图 4所示。从图 4(a)可以看出，低温胁迫后，不同品种花椒叶片可溶性糖含量均呈升高趋势；在4~2 ℃低温胁迫下，‘狮子头’和‘凤椒’叶片可溶性糖含量的增幅均高于‘莱芜少刺’，分别为157.14%、110.42%。可溶性糖含量在低温胁迫时有明显上升趋势，说明植物对前期的低温胁迫较为敏感，低温胁迫后迅速做出抵御反应。在2~0 ℃降温过程中，‘莱芜少刺’叶片可溶糖含量迅速升高，超过‘狮子头’和‘凤椒’。在-2~-4 ℃低温胁迫下，‘莱芜少刺’和‘凤椒’叶片的可溶性糖含量大致保持平行上升，将大分子糖含量维持在较高水平，增加细胞质浓度，更进一步抵御低温胁迫；‘狮子头’叶片的可溶性糖含量仅升高0.8%，此时可认为‘狮子头’叶片的可溶性糖含量基本达到峰值。

	图 4 不同低温胁迫后花椒叶片渗透调节物质含量的变化 Fig. 4 Changes in the content of osmotic adjustment substances in Z. bungeanum leaves after low temperature stress
图选项

不同低温胁迫后3种花椒可溶性蛋白含量变化趋势如图 4(b)所示。‘莱芜少刺’和‘狮子头’叶片的可溶性蛋白含量在4 ℃时已维持在较高水平，而‘凤椒’叶片的可溶性蛋白含量则最低。在不同低温胁迫下，花椒叶片可溶性蛋白含量均高于对照，可溶性蛋白含量变化规律基本一致，均随低温胁迫加重而呈上升趋势。

Pro是细胞内重要的渗透调节物质，植物通过自身渗透调节来抵御低温胁迫。在低温胁迫下，不同品种花椒叶片的Pro含量均有不同程度升高[图 4(c)]。在4~2 ℃低温胁迫下，与对照相比，‘凤椒’叶片的Pro含量升高154.4%，‘莱芜少刺’和‘狮子头’分别升高19.98%、71.48%。在2~-4 ℃低温胁迫下，‘莱芜少刺’和‘狮子头’叶片的Pro含量均明显升高，分别升高433.29%、231.76%，而‘凤椒’只升高19.85%，可见在低温胁迫后期‘凤椒’叶片Pro含量升高趋势逐渐减弱。在-2~-4 ℃低温胁迫下，‘莱芜少刺’和‘狮子头’叶片的Pro含量均超过‘凤椒’。可见，不同品种花椒对各低温区间的适应能力及反应程度有明显差别。

花椒叶片Chl含量随着低温胁迫的加重而逐渐降低(图 5)，且变化趋势基本一致。在4~-2 ℃低温胁迫下，花椒叶片Chl含量下降趋势较平缓，但在-2~-4 ℃低温胁迫下则迅速下降，可见此时的低温胁迫对花椒叶片Chl含量产生了很大的影响。在-2 ℃低温胁迫下，‘狮子头’、‘莱芜少刺’及‘凤椒’叶片Chl含量分别比对照降低了22.46%、24.35%、19.98%；在-2~-4 ℃低温胁迫下，‘狮子头’、‘莱芜少刺’及‘凤椒’叶片Chl含量分别比对照降低57.13%、55.80%、65.11%，可见，低温胁迫加重, 花椒叶片中的叶绿素含量则明显下降，致使植物合成有机物的速度下降。

	图 5 不同低温胁迫后花椒叶片叶绿素含量的变化 Fig. 5 Changes in chlorophyll content in leaves of Z. bungeanum under low temperature stress
图选项

SOD活性提高可以有效地降低低温导致的膜脂过氧化程度，Chl加快合成有机物，可维持植物生理生长需要。随着胁迫增强，保护性酶活性逐渐到达阈值，渗透调节物质浓度升高，以进一步抵御低温胁迫，减少伤害。可见，低温胁迫下，植物体内各个生理指标间密切相关，均在抵御低温胁迫中起着复杂的协调作用。抗寒性指标的隶属函数值及综合评价结果(表 3)表明，‘莱芜少刺’中可溶性糖和可溶性蛋白含量高于其他品种，按照不同隶属值排序得出3种花椒品种的抗寒性由强到弱依次为‘莱芜少刺’、‘狮子头’、‘凤椒’。

低温胁迫时植物生物膜由液相演变成凝胶相后膜透性增大、细胞内溶质外渗增多，REC是反映叶片受损伤程度的比较直观的指标^[11]。随着低温胁迫温度降低，3个花椒品种的REC均出现不同程度的升高趋势。抗寒性较强的品种细胞膜透性小，细胞浸提液的REC越小。

SOD、POD是植物体内的防御性保护酶，在植物受到胁迫时清除活性氧(activated oxygen species, AOS)的能力会逐渐增强，将O^2-和H⁺转化成H₂O₂和O₂，POD继续参与H₂O₂的分解，保护酶活性的高低与植物抗寒性强弱有着密切关系^[12]。当植物遭受持续性低温胁迫后，细胞内活性氧产生和清除的动态平衡被打破，活性氧积累过多会损伤植物细胞^[13-14]。为维持植物生长的正常状态，细胞中的抗氧化机能被活性氧诱导激活，清除自由基以维持自身动态平衡状态^[15]。小麦(Triticum aestivum L.)在低温胁迫下, MDA含量越低，则抗寒性越强，机体的自我保护能力也就越强^[16]。试验结果表明，MDA积累增多抑制了SOD、POD活性，最终保护酶活性不足以消除活性氧导致生物膜受损，抗寒性减弱。低温胁迫下，不同品种花椒的SOD和POD活性均呈“S”形变化。随低温胁迫加剧，膜脂过氧化严重，保护酶活性逐渐降低，植物受冻害程度逐渐加重。MDA含量与保护酶活性呈负相关关系，在低温胁迫后期，保护酶活性降低，MDA含量急剧增加，严重超过植物应对能力，花椒冻害严重。

低温胁迫下植物体内的可溶性糖会进行溶质的积累，防止细胞质形成小冰晶凝结，提高植物的抗寒能力^[17-18]。可溶性蛋白增加可以提高细胞内的束缚水含量，从而降低植物因细胞内结冰而致死的可能性，其含量高低可以反映植物体受冻害程度^[19]。Pro是植物蛋白组成成分之一，植物在遭受低温胁迫时会大量积累(可能升高10~100倍)，其在稳定细胞结构、提高保水力及调节细胞氧化方面有重要的作用^[20-21]。在低温胁迫下不同品种花椒的可溶性糖、可溶性蛋白及Pro含量均升高，这与曼地亚红豆杉(Taxus media Hicksii)在低温下渗透调节物质含量会逐步升高相一致^[22]，说明这些可溶性渗透调节物质是衡量花椒抗寒性强弱的重要指标。试验结果表明，低温胁迫会加速Pro的积累，降低细胞内渗透势，以提高细胞吸水能力维持正常膨压。低温胁迫促进渗透调节物质增加，通过渗透调节物质提高应对低温胁迫能力，使植物体在胁迫条件下吸收水分，从而保持细胞内结构及内外环境的平衡，以维持细胞正常的生理生长。但持续性的低温会导致植物内部生理活动紊乱，超过植物忍受阈值后，植物会快速萎蔫直至死亡，造成严重的不可逆伤害。

在低温胁迫下多数植物的光合速率会有明显下降，直接原因是低温影响光合组织的结构和活性^[23-24]。低温胁迫初期，植物的Chl含量较高，可以保证一定的光合速率，合成有机物，维持呼吸需要，也利于形成可溶性糖、可溶性蛋白等溶质以调节细胞的渗透势，以应对外部胁迫^[25-27]。试验结果表明，Chl含量随低温胁迫时间延长而降低。在低温胁迫初期，植物叶片为应对低温胁迫会主动降低Chl合成速率，以适应低温环境；在低温胁迫后期，持续性的低温导致细胞机械性冻害，Chl合成速度停滞，甚至导致Chl分解。

综上所述，持续性的低温胁迫会导致花椒生长发育缓慢甚至停滞，影响花椒正常的生长发育。综合各项数据指标及隶属函数法系统评价，结果表明, 3个花椒品种的抗寒性强弱为：‘莱芜少刺’>‘狮子头’>‘凤椒’。