纤维素是世界上最丰富的可再生资源，能够被纤维素酶转化为葡萄糖^[1]。由于纤维素不易降解，使用自然界中的微生物对纤维素进行生物转化，可以提高纤维素的降解效率，降低能耗，减少污染，更加安全。到目前为止，许多微生物被证明降解纤维素的效果显著^[2-4]，而青霉菌被认为是最有潜力生产纤维素酶的微生物群^[5]。

倒木维持着森林生态系统功能的稳定平衡和林木的快速更新，其组成以半纤维素、木质素和纤维素为主^[6]。微生物是倒木分解过程的重要参与者，它能反映环境因子对倒木分解速率的影响^[7]。木材腐朽菌作为真菌的一类，能够将木材中的木质素、纤维素和半纤维素降解为营养物质，供植物幼苗吸收利用^[8-9]。

目前，对福建省天宝岩国家级自然保护区长苞铁杉(Tsuga longibracteata Cheng)原始林中倒木的研究主要集中在对其倒木接触处土壤酶活性变化及环境效应^[10-11]、倒木的基本特性及其环境效应^[12]以及倒木的燃烧性^[13]等。简立燕等^[14]对木材腐朽真菌高产纤维素酶菌株进行了鉴定，但缺少对其菌株培养条件的优化。鉴于此，本研究拟在前期分离筛选出的3个高产纤维素酶木材腐朽菌的基础上^[14]，进一步对其培养条件和培养组分进行优化研究，以期确定其最适产酶条件，为加快长苞铁杉倒木的分解、促进长苞铁杉的自然更新提供理论依据。

以前期筛选的3个高产纤维素酶长苞铁杉木材腐朽真菌为供试菌株：郝克(氏)青霉菌(Penicillium harkeli, 标记为CB1)、小刺青霉(P. parvum, 标记为CB2)和光孢青霉(P. photosporum, 标记为CB3)。

在马铃薯斜面培养基(potato slant medium, PDA)上分别接种纯化的菌株CB1、CB2和CB3，当菌株长出均匀的绿色孢子后，放于4 ℃冰箱中保存。将50 mL的液态孢子培养基加入250 mL三角瓶中，用纱布封口，灭菌，随后接种斜面培养的孢子，在28 ℃、120 r·min^-1的条件下振荡72 h。在无菌的条件下，将70 mL改良马丁液体培养基装入250 mL三角瓶，接入保存在冰箱4 ℃下的菌株CB1、CB2和CB3，27 ℃、160 r·min^-1振荡2~3 d。

羧甲基纤维素酶(carboxymethyl cellulase activity, CMCase)、滤纸酶(filter paper enzyme, FPase)活性参考姜琳琳等^[15]的方法测定。

在基础培养基中分别加入不同的碳源(稻草粉、麦秸粉、稻草粉+麦麸、麦秸粉+麦麸)和氮源(硫酸铵、氯化铵、硝酸钾、尿素)，加入量均为总体积的1%，随后灭菌，接入5%(体积分数)的种子液，培养条件为装液量200 mL·L^-1、28 ℃、120 r·min^-1摇床振荡培养72 h，每个处理均设置3个重复，随后测量菌液的光密度(optical density, OD)值，测定CMCase及FPase活性，分别确定菌株CB1、CB2、CB3的最佳碳源、氮源。不改变菌株的其他培养条件，分别改变培养基的初始pH值(3、4、5、6、7)、摇床转速(100、120、140、160、200 r·min^-1)、接种量(体积分数分别为3%、5%、7%、9%、11%)、培养温度(20、24、28、32、36 ℃)，培养4~5 d，测量菌液OD值，测定CMCase和FPase活性，分别确定各菌株的最适培养基初始pH值、摇床转速、接种量及培养温度。

根据菌株各培养条件的单因素试验优化结果，按正交试验L₉(3⁴)对初始pH值(A)、培养温度(B)、摇床转速(C)及接种量(D)共4种培养基条件进行优化，每个处理3个重复。

用Excel 2018软件进行数据处理并制图，用SPSS 25.0软件进行统计分析。

不同碳源对不同菌株CMCase和FPase活性的影响如图 1所示，以稻草粉+麦麸为培养基的复合碳源，由于小麦麸皮含有蛋白质、矿物质、维生素等多种营养物质，能诱导产生产酶所需的纤维素、半纤维素，为微生物的生长提供营养物质，故CB1、CB2、CB3的酶活性均达到最高值。因此，稻草粉+麦麸最佳碳源。

	注：不同小写字母表示各处理间有显著性差异(P < 0.05)。Note: different lowercase letters indicate significant differences between the treatments(P < 0.05). 图 1 不同碳源对不同菌株羧甲基纤维素酶和滤纸酶活性的影响 Fig. 1 Effects of different carbon sources on CMC enzyme and FP enzyme activities of different strains
图选项

不同氮源对不同菌株CMCase和FPase活性的影响如图 2所示，以KNO₃为培养基的氮源，菌株CB1、CB2、CB3的酶活性均达到最高值，且菌株的酶活性在4种不同氮源培养基培养下均存在显著性差异(P < 0.05)，因此，KNO₃为最佳氮源。

	注：不同小写字母表示各处理间有显著性差异(P < 0.05)。Note: different lowercase letters indicate significant differences between the treatments(P < 0.05). 图 2 不同氮源对不同菌株羧甲基纤维素酶和滤纸酶活性的影响 Fig. 2 Effects of different nitrogen sources on CMC enzyme and FPA activities of different strains
图选项

在不改变其他培养条件的情况下，通过改变培养基初始pH值来确定初始pH值对菌株酶活性的影响，结果如表 1所示。当初始pH值在3~5之间变化时，3个菌株的酶活性均随着pH值的增大而升高，当初始pH值为5时，菌株的酶活性达到峰值；随后酶活性均随着初始pH值的增大而降低。因此，初始pH值为5是最佳初始pH值。

在不改变其他培养条件的情况下，通过改变摇床转速来确定摇床转速对菌株酶活性的影响，结果如表 2所示。不同菌株酶活性均以140 r·min^-1为最高值，向两边递减。因此，最佳转速为140 r·min^-1。

在不改变其他培养条件的情况下，通过改变菌株接种量的比例(体积分数分别为3%、5%、7%、9%、11%)来确定接种量对菌株酶活性的影响，结果如表 3所示。当接种量为3%~11%时，菌株CB1、CB3的酶活性先上升，随后逐渐减弱，当接种量为7%时，酶活性达到最高值；而菌株CB2的酶活性随着接种量的增加而降低，在接种量为5%时，酶活性出现最高值。因此，确定菌株CB1、CB3的最适接种量为7%，菌株CB2的最适接种量为5%。

在不改变其他培养条件的情况下，通过改变菌株培养温度来确定培养温度对菌株酶活性的影响，结果如表 4所示。当培养温度为20~36 ℃时，菌株的酶活性先是随培养温度的升高而升高，当培养温度为28 ℃时，菌株酶活性达到峰值，随后伴着培养温度的升高而降低。在培养温度为28 ℃时，菌株CB1、CB2、CB3酶活性均最高。因此，最适培养温度为28 ℃。

根据单因素试验的结果，菌株CB1与CB3的最大酶活条件为初始pH值5、摇床转速140 r·min^-1、接种量7%、培养温度28 ℃；菌株CB2的最大酶活条件为初始pH值5、摇床转速为140 r·min^-1、接种量5%、培养温度28 ℃，据此设计了菌株CB1、CB2、CB3的正交试验(表 5)，得到表 6的结果。

从表 6可知，对于菌株CB1、CB2、CB3来说，最佳产酶处理组合均为A₂B₂C₂D₃，而A₂B₂C₂D₃作为3个菌株的最佳产酶组合，并没有出现在正交试验表中，因此补做试验，结果显示：在处理组合A₂B₂C₂D₃中，菌株CB1的CMCase活性为332.321 U·mL^-1，FPase活性为119.555 U·mL^-1，分别较优化前(CK)提高了18.28%、34.55%，菌株CB2的CMCase活性为349.684 U·mL^-1，FPase活性为143.035 U·mL^-1，分别较CK提高了18.20%、30.98%，菌株CB3在处理组合A₂B₂C₂D₃中, CMCase和FPase活性分别比CK提高了25.34%、24.10%，3个菌株的最佳产酶处理组合(A₂B₂C₂D₃)与正交试验表中最大产酶量处理组合(A₂B₁C₂D₃)相比均有提高。

在最适碳源和氮源的研究中，由于小麦麸皮含有蛋白质、矿物质和维生素等多种营养物质能诱导产酶的纤维素、半纤维素，为微生物的生长提供营养物质，使得以复合碳源为碳源的菌株产酶量总是大于单一碳源，而水稻、麦秸表层均含有蜡质层^[15]，在试验时未进行有机溶质预处理，限制了青霉菌对其的有效利用，导致产酶量低下；尿素作为唯一氮源时，会使培养基pH值增大，而pH值增大会抑制纤维素酶的合成过程，导致产酶量低。在菌株的最佳产酶条件确定中，菌株生长的初始pH值会影响其对培养基营养物质的吸收，环境中pH值的变化会降低培养基被青霉菌利用的有效性，过高或过低的pH值都不能令微生物很好地生长。通过改变摇床转速能够控制摇瓶内菌株与氧气的接触程度，适当的摇床转速可以使摇瓶内溶解氧浓度增加，且有利于菌丝与摇瓶内的营养物质充分接触，但转速增大的同时，也会增大剪切力，导致菌丝断裂，影响菌株的生长与产酶^[16]；接种量的大小直接影响着菌株消耗底物的速度，当接种量过小时，会造成菌株数量较少，会增加木材腐朽菌生长的延滞期，而过大的接种量会迅速地消耗培养基里的营养物质；培养温度与菌株体内酶和蛋白质的活性息息相关，适宜的温度能促进菌株的生长，不适宜的温度直接影响菌株的酶活性，过高的温度会使其失活、酶活性降低，甚至导致菌株死亡。结合单因素试验和正交优化试验，对3株青霉菌的培养基进行优化后，选出产酶最优的处理组合，与CK的产酶量相比，均有所提高。与其他试验相比^[17]，菌株产纤维素酶的最适碳源、氮源及各最佳培养组分都略有不同，可能是不同菌株对培养条件的适应及耐受力不同，且多种培养条件组合方式较多，造成最高产纤维素酶活性组合的不同^[17-18]。课题组前期在天宝岩国家级自然保护区内取得倒木，综合运用多种方法多次分离、筛选，并通过刚果红水解及滤纸崩解，分离筛选出具有高产纤维素酶的木材腐朽菌^[14]，再经菌株形态学及18SrDNA序列分析后确定分别为郝克(氏)青霉菌(CB1)、小刺青霉(CB2)、光孢青霉(CB3)，本研究在此基础上进一步对其培养条件进行单因素和正交试验优化，但仅探讨了不同碳源、氮源、初始pH值、摇床速度、接种量和培养温度对青霉菌产酶量的影响，而微生物的生长代谢同样需要微量元素的参与，今后的研究应进一步研究无机盐对其产酶量的影响^[19]。本研究采用正交试验方法，得出3个菌株的最佳产酶条件，与其他方法(例如响应面优化法^[20])相比，试验次数相对较少。由于前期试验在样本选择的过程中大都为倒木边材，未考虑不同木材质地、腐烂等级等对菌株生长因素的影响，因此，今后的研究应更深入、系统地研究青霉菌培养条件最佳碳源、氮源的组分比例或最佳浓度，以确定天宝岩长苞铁杉倒木中青霉菌的最佳产酶条件，从而为保护森林生态系统的平衡、稳定和促进其物质循环提供有力保障。

稻草粉+麦麸为菌株CB1、CB2、CB3的最佳碳源，KNO₃为菌株CB1、CB2、CB3的最佳氮源。菌株CB1与CB3的最佳产酶条件是初始pH值为5、摇床转速为140 r·min^-1、接种量(体积分数)7%、培养温度28 ℃；菌株CB2的最佳产酶条件是初始pH值为5、摇床转速为140 r·min^-1、接种量(体积分数)5%、培养温度28 ℃。在最优培养条件下，菌株CB1的CMCase比CK提高了18.28%，FPase比CK提高了34.55%；菌株CB2的CMCase比CK提高了18.20%，FPase比CK提高了30.98%；菌株CB3的CMCase较CK提高了25.34%，FPase较CK提高了24.10%，研究结果可为研究长苞铁杉倒木分解和促进长苞铁杉天然更新提供理论依据。