桉树(Eucalyptus spp.)具有适应性强、耐旱、轮伐期短、经济效益高等优良特性，被联合国粮食及农业组织列为三大速生造林树种之一^[1]。桉树自引入我国就迅速成为最主要的外来速生丰产商品树种。桉树焦枯病(Calonectria leaf blight)是由丽赤壳属(Calonectria)真菌引起一种常见病害^[2]，受害植物叶片焦枯、溃疡, 枝干腐烂，严重时整株植株枯死^[3]，对桉树幼苗和人工幼林造成极大的影响，严重制约了桉树产业的可持续发展。丽赤壳属寄主广泛，主要危害热带和亚热带的林业、农业和园艺作物，尤其是豆科、松科、桃金娘科、杜鹃花科等植物^[4]。据统计，丽赤壳属有13个集群，其中桉树焦枯病菌(Calonectria pseudoreteaudii)是福建省内发现最早、分布最广、致病性最强的种^[5-6]。

目前，国内外对桉树焦枯病菌的研究主要集中在生物学特性、综合防治、基因组测序等方面^[7]，在分子生物学水平上对其致病机理的研究主要包括：初步获得了桉树焦枯病菌侵染后的桉树基因表达轮廓及若干个抗病相关的蛋白，揭示了与桉树防御反应有关的代谢途径及信号通路^[8]；对桉树焦枯病菌进行全基因组和比较基因组分析，对若干致病相关基因进行鉴定和功能预测，并找到了若干致病因子^[9]。致病菌毒素作为主要的致病因子，其致毒机理尚无文献报道。病原菌毒素是致病菌在侵染植物时产生的对寄主有毒害作用的一类重要的次级代谢产物，其致病机理十分复杂，它能够抵抗植物的防御机制，破坏寄主细胞，引起寄主植物病理反应，是重要的致病因子之一^[10]。从目前的研究来看，病原菌毒素的作用位点主要是在寄主细胞质膜、线粒体、叶绿体等细胞结构上。毒素破坏细胞的膜体系，严重影响植物的代谢过程及能量改变，引起寄主蛋白、核酸、酶等一系列不良反应，导致生理失调，细胞死亡以致整个植株枯死^[11]。根据对植物的作用特异性，真菌毒素可分为寄主专化性毒素(host specific toxins，HST)和非寄主专化性毒素(non-host specific toxins，NHST)^[12]。已发现确定产生HST的真菌有二十几种，包括链格孢属(Alternaria)和长蠕孢属(Helminthosporium)等9个属；NHST近60种，常见的有镰刀菌属(Fusarium)、长蠕孢属、链格孢属等。不同植物对毒素的敏感性不同，可以用来区分植物抗病性的强度^[13]。培养获得毒素活性成分并进行结构鉴定是真菌毒素的研究热点，本研究对YA5j2菌株的产毒条件及致病性进行研究，为进一步探讨桉树焦枯病菌的病原菌毒素形成及致病机制提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

供试桉树焦枯病菌株(YA5j2)、尾巨桉3229号(Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis 3229)由福建农林大学森林保护研究所提供。植物叶片采集自福建农林大学校园内常见的丽赤壳属寄主植物及园林植物。

1.2 培养基的制备

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar medium，PDA): 20 g葡萄糖、200 g马铃薯、20 g琼脂、1 000 mL纯水。桉树叶煎汁葡萄糖培养基(eucalyptus leaf broth dextrose medium，AD)：20 g葡萄糖、60 g桉树叶片、1 000 mL纯水。查彼培养基(Czapek medium，Czapek)：30 g蔗糖、0.5 g KCl、2 g NaNO₃、1 g K₂HPO₄、0.5 g MgSO₄·7H₂O、0.01 g FeSO₄、1 000 mL纯水。改良费氏培养基(modified Fries′ medium，Fries′)：30 g蔗糖、0.5 g NaCl、1 g NH₄NO₃、1 g MgSO₄·7H₂O、0.1 g CaCl₂结晶、5 g酒石酸铵、0.5 g酵母浸、1 000 mL纯水。改良费氏3培养基(modified Fries′3 medium，Fries′3)：20 g蔗糖、0.1g NaCl、1 g NH₄NO₃、1 g KH₂PO₄、1 g MgSO₄·7H₂O、0.1 g CaCl₂·2H₂O、5 g酒石酸铵、1 g酵母浸、1 000 mL纯水。马铃薯蔗糖培养基(potato sucrose medium，PS)：20 g蔗糖、200 g马铃薯、1 000 mL纯水。马铃薯葡萄糖培养基(potato dextrose medium，PD)：20 g葡萄糖、200 g马铃薯、1 000 mL纯水。

1.3 粗毒素的提取

将YA5j2菌株接到PDA平板上，28 ℃下培养10 d，在菌落边缘取5个直径为6 mm的菌饼接种到装有150 mL Fries′培养基的三角锥瓶中，然后置于摇床中(28 ℃、120 r·min^-1)连续培养15 d取出，用四层无菌纱布滤去大部分菌丝，将滤液低温离心(5 000 r·min^-1，4 ℃)18 min，上清液过细菌滤器(d_滤膜孔=0.22 μm), 得无菌丝毒素滤液，将无菌丝毒素滤液在45 ℃旋转蒸发器中低压旋转蒸发至原体积的1/10，即得含毒滤液^[14]。

1.4 生物活性的测定

将收集到的含毒滤液过大孔吸附树脂柱(HP-20型号, 三菱化学公司, 日本)，用超纯水洗脱除去糖、氨基酸和无机盐等，用甲醇洗脱柱上的物质，将洗脱液旋转蒸干得到粗毒素Cp.0。用4%二甲基亚砜溶解粗毒素Cp.0，加纯水稀释为1、2、3、4、5 mg· mL ^-1 5个浓度梯度。生物活性测定采用离体叶片针刺法^[15]，以4%的二甲基亚砜为对照(CK)，设3次重复。处理后的叶片置于25 ℃温室中保湿培养(3 400 lx，光照16 h，黑暗8 h；6:00~20:00，23 ℃；20:00~6:00，21 ℃)，4 d后用体视显微镜(Nikon SMZ18，日本)观察并拍照，利用NIS-Elements D专业图像处理软件的几何测量功能计算叶片病斑面积。

1.5 培养条件对菌株产毒的影响 1.5.1 培养基筛选

在Czapek、Fries′、Fries′3、AD、PS、PD培养基中分别接入5个YA5j2菌饼，放入温度为28 ℃、转速为120 r·min^-1的摇床中培养15 d，设3次重复，下同。除本试验外，其余试验所用培养基均为Fries′培养基。粗毒素制备及生物活性测定方法见1.3、1.4。

1.5.2 培养时间

将接菌培养基置于温度为28 ℃、转速为120 r·min^{- 1}的摇床中培养，培养时间分别为5、10、15、20、25、30 d。

1.5.3 培养温度

分别将接菌培养基置于19、22、25、28、31、34 ℃的摇床中培养15 d，转速均设为120 r·min^{- 1}。

1.5.4 培养基pH值

用0.1 mol·L^-1NaOH和0.1 mol·L^-1HCl调节培养基pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9，在28 ℃、转速为120 r·min^-1的恒温振荡下培养15 d，生物活性测定时将粗毒素的pH值调整至7。

1.5.5 光照与振荡条件

设置6种处理：全光照(持续光照24 h)+静止培养(震荡0 h)；全光照(持续光照24 h)+震荡培养(震荡24 h，120 r·min^-1)；昼夜自然交替(光照12 h，黑暗12 h)+静止培养(震荡0 h)；昼夜自然交替(光照12 h，黑暗12 h)+震荡培养(震荡24 h，120 r·min^-1)；全黑暗(黑暗24 h)+静止培养(震荡0 h)；全黑暗(黑暗24 h)+连续震荡培养(震荡24 h，120 r·min^-1)，培养15 d后制备粗毒素。

1.6 桉树焦枯病菌粗毒素的专化性测定

不同种类植物对桉树焦枯病菌粗毒素的敏感性不同，根据病情分级标准^[16]，分成6个等级：0级(不敏感，无明显病斑)、1级(稍敏感，病斑面积0~4 mm²)、2级(较敏感，病斑面积4~8 mm²)、3级(敏感，病斑面积8~12 mm²)；4级(很敏感，病斑面积12~16 mm²)、5级(极敏感，病斑面积>16 mm²)。

2 结果与分析 2.1 生物学活性测定

用不同浓度的粗毒素处理桉树叶片，浓度越高病斑面积越大(图 1)，且与田间发病叶片症状相似。当粗毒素浓度为5 mg· mL ^-1时，在叶片上产生的病斑面积为3.65 mm²，对叶片的伤害作用最大，与其它浓度差异显著；当粗毒素浓度为3、4 mg· mL ^-1时，毒素生物活性相差不大；当粗毒素浓度为1、2 mg· mL ^-1时，因浓度较低，在叶片上没有产生明显的病斑。叶片病斑面积与粗毒素的浓度成正相关关系。

2.2 培养条件对菌株产毒的影响 2.2.1 培养基对YA5j2菌株产毒的影响

YA5j2菌株在各供试培养基上均能生长，但不同培养基质对其产毒有较大影响[图 2(a)]。菌株在Fries′培养基中产毒能力最强，叶片病斑面积最大，达到18.39 mm²，与其它培养基存在显著差异(P < 0.05)；在Fries′3、AD、Czapek培养基中，菌株产毒能力次之；在PS、PD培养基中的产毒能力最弱，叶片上无明显病斑。YA5j2菌株在AD培养基中的产毒量不多，说明桉树叶煎汁对其产毒无明显诱导作用。

2.2.2 培养时间对YA5j2菌株产毒的影响

在培养基中摇培的前20 d，YA5j2菌株的菌丝快速生长，培养基颜色由浅褐色逐渐加深为深褐色。随着培养时间的延长，YA5j2菌株产毒量也逐渐增多，到第20天时达到最高峰，在叶片上产生的病斑面积最大，达到13.91 mm²[图 2(b)]，此时菌株的毒素致病性最强，与其它时间存在显著差异。20 d后，YA5j2菌株产毒量有所减少。

2.2.3 培养温度对YA5j2菌株产毒的影响

从[图 2(c)]可以看出，YA5j2菌株在19~34 ℃均可产毒，在19~28 ℃时，随着温度的升高，产毒能力增强，28 ℃时菌株产毒能力最强，随后随着温度升高产毒能力减弱。菌株较适产毒温度为25~34 ℃，与其它温度的产毒量差异显著，说明高温条件有利于YA5j2菌株产毒。

2.2.4 pH值对YA5j2菌株产毒的影响

YA5j2菌株在Fries′培养基摇培时，当培养基pH值为2~5时，其产毒量随pH值的上升而增加[图 2(d)]，当pH值为5时，达到最高峰。随后YA5j2菌株产毒量随pH值的上升逐渐减少，当pH值为9时，其产毒能力急剧减弱。当pH值为5时，叶片的病斑面积最大，与其它pH值的产毒量存在显著差异，表明桉树焦枯病菌适宜在偏酸的条件下产毒。

2.2.5 光照及震荡条件对YA5j2菌株产毒的影响

光照及震荡条件对YA5j2菌株的产毒有很大的影响[图 2(e)]。在持续震荡的条件下，全黑暗、昼夜交替培养的YA5j2菌株产毒能力均较强，而24 h持续光照培养的菌株产毒量最少，病斑面积最小，说明持续光照抑制了桉树焦枯病菌的产毒能力。在静置的条件下，全黑暗、昼夜交替、全光照培养的YA5j2菌株产毒能力均较弱，差异不显著，说明该菌产毒需要大的通气量。YA5j2菌株在全黑暗、连续振荡的条件下，产毒能力最强，与其它培养条件差异显著。

2.3 菌株毒素的专化性测定

YA5j2菌株产生的毒素不仅对寄主有致病作用，对其他非寄主植物也有毒性作用。不同植物对毒素的敏感性不同(表 1)，其中小叶榕、白兰、樟树、桂花对毒素极敏感；金叶假连翘、龙眼、红背桂花次之；凤眼蓝、毛杜鹃、朱槿、杨梅、番石榴、柳树对毒素较敏感；红花檵木、台湾相思、荔枝、橡胶树、栀子花、柚子、金桔、竹对毒素稍敏感，抗性较强。专化性测定表现出多样性，说明该毒素属于非寄主专化性毒素。

3 讨论与结论

真菌毒素的产生通常会受到多种环境因素的调控，其中培养基种类、培养时间、培养温度、培养基pH值、光照及振荡条件等都是影响病原菌产毒的重要因素^[17]。培养基成分对YA5j2菌株产毒有很大的影响，对比PD、PS、AD、Czapek、Fries′3、Fries′几种培养基的产毒能力，其中Fries′培养基最适合产毒。培养时间的长短也是决定毒素活性强弱的一个重要影响因素，随着培养时间的延长，产毒量增多，超过一定时间范围，培养基中的营养物质减少，病原菌的生长受到限制，毒素可能发生降解或性质发生变化，进而影响毒素的生物活性。温度是调控真菌次级代谢产物产生的重要因素，桉树焦枯病菌产毒的最适温度为25~34 ℃，与其最适生长温度不一致^[2]，但与大多数真菌产毒偏好相符^[17]。当培养基pH值小于3和大于8时，YA5j2菌株产毒量少，说明在强酸和强碱的条件下不利于该菌株产毒，偏酸的环境适合菌株产毒，与BRZONKALIK et al ^[18]研究的pH值对互隔交链孢霉(Alternaria alternata)DSM 12633产毒影响的结果一致。震荡培养时，YA5j2菌株产毒量多，说明桉树焦枯病菌的产毒需要较好的通氧量。持续光照抑制了YA5j2菌株产毒，这是因为光照不仅对真菌毒素的形成有调控作用，还能降解真菌毒素^[19]。因此，在pH值为5的Fries′培养基中，28 ℃下全黑暗振荡培养20 d为桉树焦枯病菌产毒的最佳条件。

供试的21种植物的致病性测定表明，该菌株的粗毒素能作用于广泛的植物种类，是一种非寄主专化性毒素，此结论和陆宁海等^[20]对多主棒孢霉菌(Corynespora cassiicola Wei)毒素致病范围测定结果相似。非寄主专化性毒素如果对农作物和林木具有一定的毒害作用，在生物源除草剂的应用上局限性较大，因为微生物源除草剂要求对目标杂草专一程度较高、毒性强，但对作物安全^[21]。非宿主专化性毒素对宿主植物的作用强度与品种的抗性有关，可广泛用于抗病育种^[22]。其中小叶榕、白兰、樟树、桂花对该毒素极敏感，将来可作为毒素评价的生测材料。此外，专化性测定显示毒素对不同种植物的致病力有差异，可以利用林木苗圃地轮作的方法来减轻桉树焦枯病的危害。毒素中的活性物质可能是作用范围较广的单一成分，也可能含有多种有效成分，有待后期深入研究。