樱花(Cerasus serrulata)是蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)的总称，为我国重要的春季木本观花乔灌木及秋季色叶树种，其花型优美，花期集中，具有较高的观赏价值，广泛应用于世界各地城市绿地系统中。樱花正常的自然花期是2月底至5月中旬，一般樱花品种一年开花一次。一年二次开花是指木本植物当年分化的花芽一部分当年开放，并在翌年再次开放的现象^[1-3]，相对于春季花期，樱花的秋季花期花量小，但持续时间更长。对于木本植物二次开花现象的记录与研究多为果树，并且研究多以预防为主，对于木本植物二次开花生理机制的研究极少^[3-5]。植物的开花特性与花芽分化的方式相关，对二次开花丁香(Syringa Linn.)品种花芽分化研究发现，同一植株的花芽存在夏秋分化型和当年一次分化型两种分化方式^[2]。对‘雪球’海棠(Malus ‘Snowdrift’)二次开花试验的研究发现，其花芽内脱落酸(abscisic acid，ABA)与细胞分裂素(cytokinin，CTK)明显高于未处理的花芽，施加外源ABA能够加快花芽分化的速率^[5]。植物激素是影响花芽分化的重要因素，不同时期植物内源激素含量及平衡控制着花芽分化的各个重要时期^[6-7]。玉米素核苷(zeatin riboside，ZR)是CTK在木质部中运输的重要形式，对刺梨(Rosa roxburghii ‘Tratt’)研究发现，其在花芽生理分化期，花芽中ZR含量有所增加，转入形态分化期，ZR含量急剧减少，在整个形态分化期都处于稳定的低含量^[8]；对大樱桃(Cerasus avium L.)^[9]、油桐(Vernicia fordii)^[10]的花芽分化期花芽内源激素变化的研究中也有相同的结果。一般认为赤霉素(gibberellin，GA₃)对木本植物花芽分化有抑制作用，喷施外源GA₃能够有效地抑制花芽分化^[11]，用外源GA₃处理桃树品种‘八月脆’(Prunus persica ‘Batsch’)后发现，GA₃能够抑制成花基因PpLEAFY及MADS 6的正常表达，从而抑制‘八月脆’的花芽分化^[12]。生长素(indoleacetic acid，IAA)是发现最早、生理作用最重要的一种植物激素，对三角梅(Spectabilis ‘Brasilliensis’)花芽分化期花芽内源激素含量变化的研究发现，进入花芽形态分化期，其花芽内IAA含量迅速下降^[13]，对杏(Armeniaca vulgaris Lam)^[14]花芽分化的研究也有相同的结果。ABA是一种利于植物器官脱离的激素，不同的植物体中ABA对花芽分化的影响不同，HOAD^[15]认为ABA在花芽分化期起负面作用，而RAKNGAN et al^[16]却认为ABA能够促进果树的花芽分化，对无花果(Ficus carica L.)^[17]花芽分化的激素含量测定则发现，随着花芽分化的进行，ABA含量不断增多。LUCKWILL^[18]研究发现，苹果(Malus pumila Mill.)短枝上花芽分化受到CTK和GA₃共同的影响，曹尚银等^[19]对苹果花芽分化过程研究发现，花芽形态分化开始后，ABA/IAA、ABA/GA_s、ZR/GA_s和ZR/IAA比值迅速升高, 达到平衡状态, 对提高成花率有重要作用。对枣(Ziziphus jujube Mill.)花分化发育过程的研究发现，ABA/GA₃比值高对花芽分化和花的发育均有利，ABA/IAA比值增大，IAA/GA₃比值减小，可促进花芽发育^[20]。因此，研究植物花芽分化期花芽内源激素含量变化对探究植物一年二次开花的原因具有重要意义。

以一年二次开花的樱花品种‘十月樱’(Cerasus subhirtella ‘Autumnalis’)和在园林中广泛应用一年一次开花的品种‘染井吉野’(C. yedoensis ‘Someo-yoshino’)为研究对象，通过测定花芽分化期花芽内4种内源激素含量的变化，分析其动态变化规律，为一年二次开花现象研究以及樱花花期调控、引种驯化和园林应用等相关研究提供理论依据。

试验材料取自青岛农业大学校园内(120°39′E，36°32′N), 地处暖温带季风气候区，年平均气温为13.6 ℃，日较差较大，年平均降水量为467.4 mm^[21]，栽种区地势平坦，土壤类型属于棕壤，含水量较高，全年光照充足。试验选取的樱花品种为二次开花品种‘十月樱’[种源：豆樱(C. incisa)×江户彼岸(C. spachiana f. ascendens)]与一次开花品种‘染井吉野’[种源：大岛樱(C. speciosa)×江户彼岸]。每个品种选取3株长势相同、大小相近的植株作为试验材料。

于2018年6月上旬开始采样，采集向阳枝条中部的花芽，每10 d采样1次，每次采取花芽数量不少于20个，经甲醛-乙酸-乙醇固定液(formaldehyde-acetic acid-ethanol fixative，FAA，V_70%乙醇:V_38%甲醛:V_冰醋酸=90:5:5)固定后置于4 ℃冰箱保存。根据石蜡切片结果，确定樱花花芽分化期为6月下旬至10月中旬，由此确定采样时间。于2019年6月22日至7月23日，每隔7 d采集1次花芽；7月23日至11月7日，每隔10 d采集1次花芽。选取向阳枝条，并分长枝(≥15 cm)与短枝(≤10 cm)分别采集，采集的枝条放入冰盒中带回实验室。采集的花芽用锡箔纸包裹，放入液氮速冻，并置于-80 ℃冰箱储存，备用。采集完成后，采用青岛农业大学中心实验室高效液相色谱仪(三重四极杆)集中测定各时期样品中的ZR、GA₃、IAA和ABA含量。

采用常规石蜡切片法，利用轮转式切片机切片(厚度为10 μm)，经苏木精染色，中性树胶封片，用显微镜观察并拍照 。

标准溶液配制：准确称取樱花花芽样品0.5 g置于研钵中，在液氮条件下研磨，4 ℃条件下提取两次，合并上清液。提取液经C18固相萃取柱提纯，过0.2 μm有机微孔滤膜，待测。操作过程避光，温度保持在4 ℃以下。色谱条件：安捷伦C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；柱温为30 ℃；进样量为2 μL；流速为0.2 mL·min^-1；流动相A为HPLC甲醇，B为1 mmol·L^-1冰醋酸溶液。质谱条件：电喷雾离子源(IAA、ZR正离子检测，ABA、GA₃负离子检测)；多反应监测扫描；离子喷雾电压为3 000 V；雾化气压力为275 kPa；鞘流气温度为350 ℃，鞘流气流速为10 mL·min；毛细管电压为3 500 V；离子源温度为325 ℃；脱溶剂气流量为8.0 L·min^-1。提取方法与仪器参数参照钟冬莲等^[22]、PAN et al^[23]的方法。

两个樱花品种‘十月樱’与‘染井吉野’的花芽分化进程如表 1所示，参照耿文娟等^[23]的方法，统计各采样时期内, 花芽各分化期所占比例及各花芽分化期持续时间。

两个樱花品种在同一原基分化期具有相似的形态特征，共分为6个时期(图 1，图 2)。分化初期，‘十月樱’分化时间为7月10日—7月25日，‘染井吉野’为7月15日—8月4日，生长点顶端的芽鳞逐渐伸展松动，芽内生长点逐渐趋于平缓，纵切面形似半球形，基部可见形态一致的分生组织细胞整齐排列[图 1(A), 图 2(A)]。花原基分化期，‘十月樱’分化时间为7月26日—8月19日，‘染井吉野’为8月5—8月29日，生长点向上隆起，顶端逐渐趋于平坦，高出苞片原基，形成纵切面近似圆柱形的花原基[图 1(B), 图 2(B)]。花萼原基分化期，‘十月樱’分化时间为8月20日—9月4日，‘染井吉野’为8月19日—9月8日，生长点顶部中心部位呈相对凹陷状态，分生细胞不断进行分裂，逐步分化形成突起，并通过平周分裂持续伸长[图 1(C), 图 2(C)]。花瓣原基分化期，‘十月樱’分化时间为9月5日—9月13日，‘染井吉野’为9月9日—9月23日，内侧基部表皮下的细胞分裂形成又一轮突起，即为花瓣原基[图 1(D), 图 2(D)]。雄蕊原基分化期，‘十月樱’分化时间为9月14日—9月28日，‘染井吉野’为9月24日—10月3日，瓣原基内侧下方继而开始形成多个椭圆状新突起，雄蕊原基数目不断增多，并不断伸长，最终发育成一轮雄蕊群[图 1(E), 图 2(E)]。雌蕊原基分化期，‘十月樱’分化时间为9月29日—10月10日，‘染井吉野’为10月4日—10月18日，生长点中央部位的细胞以平周分裂的方式形成向上的突起，两端分裂的方式向上延伸，最后心皮的顶端与侧部合拢，形成雌蕊原基原始体[图 1(F), 图 2(F)]。

	图 1 ‘十月樱’花芽形态分化各时期石蜡切片图 Fig. 1 Images showing the morphological differentiation of C. subhirtella 'Autumnalis' flower bud in different periods
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	图 2 ‘染井吉野’花芽形态分化各时期石蜡切片图 Fig. 2 Images showing the morphological differentiation of C. yedoensis 'Someo-yoshino' flower bud in different periods
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由图 3可见，在生理分化期向形态分化期转变的过程中，‘十月樱’花芽内ABA含量保持较高水平，平均浓度超过100 ng·g^-1，而‘染井吉野’花芽内ABA含量从分化初期到花萼原基分化期处于减少的状态。进入花原基分化期后，两个樱花品种花芽内ABA含量均快速减少，并在花萼原基分化期达到最低值，‘十月樱’长枝花芽内ABA含量为31.9 ng·g^-1，短枝花芽内ABA含量为35.6 ng·g^-1，‘染井吉野’花芽内ABA含量为42 ng·g^-1。花萼原基分化期后，两个樱花品种花芽内ABA含量持续增多，在雄蕊、雌蕊原基分化期，两个樱花品种花芽内ABA含量均保持在较高水平。在花萼原基分化期前，‘十月樱’花芽内ABA含量明显多于‘染井吉野’的，从花瓣原基分化期到雌蕊原基分化期，‘染井吉野’花芽内ABA含量则多于‘十月樱’的。

	图 3 花芽分化期花芽内脱落酸含量的动态变化 Fig. 3 Dynamic changes in ABA content in flower bud differentiation
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由图 4可见，两个品种的樱花在整个花芽分化期，花芽内GA₃含量整体呈减少的趋势，在生理分化期向形态分化期转变的过程中，花芽内GA₃含量快速减少，并且在整个花芽分化期含量均较少。在花原基分化期和雄蕊原基分化期，‘十月樱’花芽内GA₃含量分别出现小高峰，随后快速减少，而‘染井吉野’花芽内GA₃含量变化不明显。在花原基分化期和雄蕊原基分化期，‘十月樱’花芽内GA₃含量显著多于‘染井吉野’的。在花萼原基分化期和花瓣原基分化期，‘染井吉野’花芽内GA₃含量略多于‘十月樱’的。

	图 4 花芽分化期花芽内赤霉素含量的动态变化 Fig. 4 Dynamic changes in GA3 content in flower bud differentiation
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由图 5可见，‘染井吉野’在花芽分化期，花芽内IAA含量明显少于‘十月樱’的，进入花萼基分化期后，花芽内IAA含量明显减少并在后续的分化时期中基本保持稳定。‘十月樱’在生理分化期向形态分化期过渡阶段，花芽内IAA含量较多，进入分化初期后，‘十月樱’短枝花芽内IAA含量快速减少，而‘十月樱’长枝花芽内IAA含量直至花原基分化期后才开始快速减少。‘十月樱’大部分花芽完成分化后，花芽内IAA含量开始增多，而‘染井吉野’的未发生明显变化。

	图 5 花芽分化期花芽内生长素含量的动态变化 Fig. 5 Dynamic changes in IAA content in flower bud differentiation
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由图 6可见，两个樱花品种在整个花芽分化期花芽内ZR含量的变化趋势大致相同。在生理分化期，两个樱花品种花芽内ZR的含量较多，进入分化初期后，ZR含量减少。进入花萼原基分化期之前，‘十月樱’花芽内ZR含量明显多于‘染井吉野’的。在花瓣原基分化期至雌蕊原基分化期，‘染井吉野’花芽内ZR含量一直缓慢减少，进入雌蕊原基分化期，‘十月樱’花芽内ZR含量略有增多。

	图 6 花芽分化期花芽内玉米素核苷含量的动态变化 Fig. 6 Dynamic changes in ZR content in flower bud differentiation
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在整个花芽分化期，两个樱花品种花芽各内源激素间(ABA/GA₃、ABA/IAA、ZR/IAA、ZR/GA₃)比值的变化情况如图 7所示。从生理分化期到花瓣原基分化期，两个樱花品种花芽的ABA/GA₃比值较小且稳定，进入雄蕊、雌蕊原基分化期后，ABA/GA₃比值明显变大[图 7(a)]。ABA/IAA比值在花萼原基分化期前无明显变化，且比值较小，‘染井吉野’花芽的ABA/IAA比值从花萼原基分化期开始增大，而‘十月樱’花芽的ABA/IAA比值从花瓣原基分化期增大，进入雄蕊原基分化期后减小，‘染井吉野’的仍保持在高水平[图 7(b)]。‘十月樱’长枝与短枝花芽的ZR/IAA比值波动不大，‘染井吉野’进入花萼原基分化期和花瓣原基分化期，ZR/IAA比值明显增大，高于‘十月樱’的，在雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期与‘十月樱’保持相同水平[图 7(c)]。‘十月樱’在整个花芽分化期内，ZR/GA₃比值存在两个高峰，分别是在萼片原基分化期和雌蕊原基分化期，从雄蕊原基分化期到雄蕊原基分化期，‘十月樱’花芽的ABA/GA₃比值上升幅度较大[图 7(d)]。

	图 7 花芽分化期不同内源激素的比值 Fig. 7 Changes in the ratio of different endogenous hormones in flower bud differentiation
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研究证明，植物内源激素是影响花芽分化重要的因素，植物内源激素通过控制核酸、蛋白质及可溶性糖等物质的代谢，从而对植物的花芽分化进行调控。花芽分化是植物由营养生长向生殖生长转变的转折点，在形态分化前生长点内部存在一系列生理状态的转变，这一阶段植物代谢变化差异大。大樱桃花芽分化期，营养生长向生殖生长转变，花芽ABA含量迅速增多，花芽分化进入形态分化期后，ABA含量迅速减少，ABA含量迅速增多有利于植物从营养生长向生殖生长转变，促使植物开始花芽分化^[9]。桂花(Osmanthus fragrans)花芽生理分化期GA₃含量的增多有利于植物生理分化期的进行^[25]。本研究结果表明，两个樱花品种花芽内GA₃和ABA的含量较多，这表明高含量的GA₃和ABA有利于促成生理分化期向形态分化期转变。进入形态分化期后，ABA含量逐渐增多，并在部分花芽分化完成后达到相对较多的含量，这与罗羽洧等^[17]对无花果、杨义标等^[26]对勒杜鹃(Bougainvillea spectabilis Willd.)花芽分化期内源激素含量变化的研究相同。在生理分化期至花原基分化期，‘十月樱’花芽内ABA和IAA含量明显多于‘染井吉野’，通过形态学切片发现，这两个期‘十月樱’花芽分化速率要快于‘染井吉野’，这表明高水平的ABA和IAA加速了‘十月樱’花芽分化的速率，为‘十月樱’能够在环境温度未降至被迫休眠前开花提供了条件。对三角梅花芽分化研究发现，进入花芽分化期后，其IAA含量迅速减少，并且在整个花芽分化期内，IAA相对含量最少^[13]。曹尚银等^[19]对苹果研究发现，花芽中IAA含量在花芽生理分化期呈现急剧减少的趋势，花芽形态分化期开始后一周，IAA含量无明显变化，趋于稳定不变状态。本研究表明，花芽形态分化期内ZR和IAA的含量逐渐减少有利于花芽分化的进行，并且油橄榄(Olea europaea L.)^[27-28]花芽分化期ZR含量，桂花^[25]花芽分化期IAA含量变化也支持这一观点。本研究表明，在雌蕊原基分化期，‘十月樱’花芽内ZR和IAA含量出现增多的趋势，而‘染井吉野’并未出现该变化，且‘十月樱’短枝花芽的ZR和IAA含量增多的趋势快于‘十月樱’长枝花芽，通过物候学观测，‘十月樱’在秋季开花过程中短枝花芽的萌芽率高于长枝花芽的，说明ZR和IAA含量增多有利于樱花完成花芽分化并促使‘十月樱’在秋季被迫休眠前在秋季开花。

植物花芽分化是一个复杂的过程，内源激素对花芽分化的作用，不仅取决于单一的激素，也取决于内源激素的动态平衡。研究表明，‘十月樱’花芽在ZR/IAA在花芽分化期内保持较稳定的平衡状态，而‘染井吉野’花芽在生理分化期到花萼原基分化期内出现了较大的波动。‘十月樱’花芽在雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期，ABA/IAA的比值要明显少于‘染井吉野’，‘十月樱’在雌蕊原基分化期，ZR/GA₃的比值明显高于‘染井吉野’，这说明花芽分化后期，花芽内源激素ABA与IAA的平衡，ZR与GA₃的平衡开始起主导作用，成为影响‘十月樱’一年二次开花的重要因素。