随着土壤环境问题愈加严重，土壤重金属污染也日益受到关注。根据《全国土壤污染状况调查公报》^[1]，工矿业废弃地的土壤环境问题突出，在调查的70个矿区的1 672个土壤点位中，超标点位占33.4%，有色金属矿区周边土壤铅(Pb)、镉(Cd)等污染较为严重。Pb是危害性最高的土壤污染物之一，Cd是生物毒性最强的重金属之一，它们长期存在于土壤中，对植物、动物和人类都具有高毒性^[2-3]。近年来发展起来的植物修复技术具有原位修复、安全、廉价、对环境无二次污染等优点，已逐渐成为研究和开发的热点^[4]。筛选具有超强富集或较强富集能力、具有较高经济应用价值的植物种类，在矿区或重金属污染土壤的植被重建和修复中起着关键性作用，研究其修复机理和修复效率，可为重金属污染土壤植物修复工作提供基础和依据^[5]。杨树(Populus L.)是修复重金属Cd污染土壤的良好树种之一，并且对Pb有较高的耐受性^[6]。国内的相关研究较少，主要体现在所研究的杨树品种较少，且多集中于单一污染和水培试验，但杨树的品种间存在遗传差异，在重金属富集能力和耐受性等方面存在不同^[7]。杨树新无性系南林95杨(Populus deltoides×P. euramericana ‘Nanlin 95’)和南林895杨(Populus deltoides×P. euramericana ‘Nanlin 895’)是从美洲黑杨(Populus deltoides W. Bartram ex Marshall)与欧美杨(Populus×canadensis Moench)杂交后代群体中选育出来的，可作为杨树单板用材、纤维板用材及纸浆用材。它们树形高大，干形通直圆满，具有尖削度小，材质好的特点，还对溃疡病和褐斑病有较好的抗性，无性繁殖能力和遗传稳定性较强。因此，本研究以南林95杨和南林895杨为研究对象，通过土培的方法，研究其对重金属Pb和Pb-Cd复合胁迫的生理响应，以期为重金属Cd、Pb污染土壤的修复提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料选择与处理

供试材料为采自南京林业大学泗阳杨树基地的南林95杨和南林895杨，插条长度15 cm(保留2~3个芽)，土壤以泥炭土、珍珠岩和蛭石按7:1:2比例混匀，扦插至高130 mm、口径为162 mm的育苗盆中，每盆栽种2株，放置在恒温26 ℃的实验室中，保证自然光照，在阴天条件下，用备有近似太阳光照的200 W白炽灯进行照射，做好日常管理，保持土壤的湿度，每4 d浇1次水，水量150~200 mL。培养8周后，挑选根系和枝叶长势良好的枝条进行重金属胁迫处理，胁迫处理50 d后，进行相关指标测定。

1.2 供试污染物

污染物的浓度设计以《GB 15618—1995土壤环境质量标准》^[8]为依据设定污染物的质量分数，Pb、Cd元素分别以Pb(NO₃)₂及CdSO₄的形式加入到土壤中，分别进行Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫处理，其中Pb处理浓度分别为0、300、600、800和1 000 mg·kg^-1；Pb-Cd复合胁迫处理浓度分别为0、Pb 300 mg·kg^-1+Cd 0.3 mg·kg^-1、Pb 600 mg·kg^-1+Cd 1.2 mg·kg^-1、Pb 800 mg·kg^-1+Cd 1.6 mg·kg^-1、Pb 1 000 mg·kg^-1+Cd 2.0 mg·kg^-1。胁迫处理50 d，每个胁迫浓度做3个重复。由于在Pb和Cd复合胁迫中，Pb和Cd的浓度是一一对应关系，所以下文图表中Pb、Cd复合胁迫浓度用Pb的浓度表示，以便Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫的比较。

1.3 试验方法

用氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyte-trazoliumchloride, TTC)法进行根系活力的测定，TTC可以用作氧化还原酶的氢受体，植物根所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸等得到增强，而被丙二醛、碘乙酸所抑制，所以TTC还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标^[9]。过氧化氢酶(catalase, CAT)活性用紫外吸收法测定；可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250^[10]法测定；叶绿素含量采用乙醇-丙酮法^[9]测定。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010软件对数据进行处理和绘图，采用SPSS 22.0软件对数据进行差异显著性检验、数据标准化处理和主成分分析，并利用隶属函数法求出2种杨树对Pb和Cd耐受性的综合评价值。为了排除树种间生长特性差异影响，引入单项指标耐受性系数(α)将各单项指标值转换成对照组测定的相对值^[11]。

$ \alpha /\% = 处理区测定值/对照区测定值 \times 100 $

(1)

单株因子得分值：

$ {C_i} = \frac{{{Y_1}{Z_{x1}}}}{{\sqrt {{\lambda _i}} }} + \cdots + \frac{{{Y_j}{Z_{xj}}}}{{\sqrt {{\lambda _i}} }}(j > i > 1) $

(2)

式中:C_i为主成分分析后提取的因子的单株因子得分值；Y_j为第i个主成分载荷矩阵表中第j个原始因子对应的载荷值；λ_i为第i个主成分的初始特征值；Z_xj为第j个初始指标α值经标准化后的值^[12]。

隶属函数值：

$ U({X_j}) = \frac{{{X_j} - {X_{ {\rm{min }}}}}}{{{X_{ {\rm{max }}}} - {X_{ {\rm{min }}}}}}{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} j = 1, 2, \cdots , n $

(3)

式中：U(X_j)为每一品种各综合指标的隶属函数值；X_j为第j个综合指标；X_min为第j个综合指标的最小值；X_max为第j个综合指标的最大值^[13]。

根据综合指标贡献率大小可求出各综合指标权重：

$ {W_j} = \frac{{{P_j}}}{{\sum\limits_{j = 1}^n {{P_j}} }}{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} j = 1, 2, \cdots , n $

(4)

式中：W_j为第j个综合指标的相对重要程度即权重；P_j为试验材料第j个综合指标的贡献率^[13]。

计算各树种综合耐受性：

$ D{\rm{ = }}\sum {\left[ {U\left( {{X_j}} \right) \cdot {W_j}} \right]} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} j = 1, 2, \cdots , n $

(5)

式中：D为各树种在Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫下用综合指标所得的耐受性综合评价值^[13]。

2 结果与分析 2.1 铅和铅-镉复合胁迫对杨树根系活力的影响

根系是直接接触重金属污染土壤的器官，极易受到重金属的毒害，其自身可通过调整形态、分布和生理生化反应来适应环境胁迫^[14]。根系活力是反映根系生命活动的重要指标，也是反映植物抗逆能力强弱的体现。图 1为不同浓度Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫下2种杨树的根系活力。由图 1(a)可以看出，Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫都对南林95杨的根系活力产生了消极的影响。在不同浓度的Pb胁迫下，南林95杨TTC还原强度比对照组分别降低了19.51%、40.17%、78.79%和84.85%。在不同浓度的Pb-Cd复合胁迫下，南林95杨的TTC还原强度比对照度分别降低了25.00%、51.85%、93.75%和95.65%，说明在复合胁迫中，Cd对Pb起到协同作用，但方差分析结果表明，Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫的F=0.22，P=0.66 > 0.05，说明Cd的浓度较低，虽然也具有毒害作用，但作用不明显。

从图 1(b)可以看出，Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫也都对南林895杨根系活力产生了消极的影响，与对照组相比，其TTC还原强度最多降低了61.95%(Pb胁迫)和63.11%(Pb-Cd复合胁迫)。从图 1可以看出，在不同浓度的Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫下，南林895杨TTC还原强度都比南林95杨高，降低幅度比南林95杨小，表明南林895杨根系活力的耐受性较南林95杨强。方差分析结果表明，Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫之间F=3.41，P=0.11 > 0.05，说明Cd对Pb具有协同作用，虽不明显但也有起到一定作用。

2.2 铅和铅-镉复合胁迫对过氧化氢酶活性的影响

重金属胁迫与其他形式的氧化胁迫具有相似性，能使植物产生大量的活性氧自由基，抗氧化酶系统的激发是植物受重金属胁迫的一种重要机制，在植物适应逆境的过程中起重要作用^[15]。CAT是抗氧化酶系统中控制植物体内活性氧积累的最主要的酶之一^[16]，图 2为不同浓度Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫下2种杨树的过氧化氢酶活性。在不同浓度Pb胁迫下，随Pb浓度的升高，南林95杨的CAT活性呈现先升高后降低的趋势，南林895杨的CAT活性则呈现小幅的下降。南林95杨的CAT活性与对照组相差48.13%~-63.15%，南林895杨的CAT活性与对照组相比小18.99%~24.22%。在不同浓度Pb-Cd复合胁迫下，随Pb-Cd浓度的升高，南林95杨的CAT活性呈现逐渐降低的趋势，南林895杨的CAT活性则呈现先升高后降低的趋势；南林95杨的CAT活性与对照组相比小35.14%~75.42%；南林895杨相差11.54%~-67.53%。方差分析结果表明，在Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫下，南林95杨的F=1.52，P=0.26 > 0.05；南林895杨的F=0.07，P=0.80 > 0.05，说明加入Cd之后对CAT活性的影响较小。在Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫下，南林95杨和南林895杨都具有较好的抗逆性，且南林895杨CAT活性变化比南林95杨小，说明南林895杨具有更好的抗逆性。

2.3 铅和铅-镉复合胁迫对杨树可溶性蛋白质含量的影响

蛋白质是维持生物体结构和功能最重要的基础物质之一，是细胞中含量最高的生物大分子。图 3为不同浓度重金属胁迫下2种杨树的可溶性蛋白质含量。由图 3(a)可知，在Pb胁迫下，南林95杨可溶性蛋白质的含量呈逐渐升高趋势，与对照组相比最多高151.76%，说明Pb促进了南林95杨可溶性蛋白质的形成，可能是在低浓度Pb胁迫下，杨树幼苗体内存在解毒机制，产生了具有解毒作用的特定蛋白^[17]。在Pb-Cd复合胁迫中，南林95杨在Pb-Cd浓度为Pb 300 mg·kg^-1+Cd 0.3 mg·kg^-1时的可溶性蛋白含量略高于在Pb浓度为300 mg·kg^-1时的含量，说明低浓度的Cd对南林95杨可溶性蛋白质的形成起到协同作用，但当Pb-Cd浓度超过Pb 600 mg·kg^-1+Cd 1.2 mg·kg^-1时，其可溶性蛋白质含量逐渐下降，直至接近对照组，但均略高于对照组，最多比对照组高2.78%，Cd对Pb的拮抗作用显著增强(F=10.08, P=0.02 < 0.05)。

从图 3(b)可以看出，Pb浓度为0~800 mg·kg^-1时，促进了南林895杨可溶性蛋白质的形成，与对照组相比其可溶性蛋白质含量最多提高了53.41%；但当Pb浓度为1 000 mg·kg^-1时，可溶性蛋白质含量下降，说明低浓度Pb胁迫促进了南林895杨可溶性蛋白质的形成。随着Pb浓度逐渐升高，超过了南林895杨的耐受阈值，可溶性蛋白质含量下降。从图 3可以看出，在Pb胁迫下南林95杨的耐受性强于南林895杨。在低浓度Pb-Cd复合胁迫下，南林895杨可溶性蛋白质含量低于对照组，可能是由于胁迫浓度小，南林895杨的应激反应较小，但随着胁迫浓度升高，南林895杨可溶性蛋白质含量升高。由此表明，在Pb-Cd复合胁迫下，南林895杨的耐受性强于南林95杨。

2.4 铅和铅-镉复合胁迫对杨树叶绿素含量的影响

光合作用是植物合成有机物和获得能量的基础。光合色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。重金属会对植物叶片的光合作用和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)的合成以及抗氧化系统等产生负面影响，诱导氧自由基产生，造成超氧化伤害，导致脂质过氧化及细胞内膜系统结构和活性的破坏^[18]。图 4为不同浓度重金属胁迫下南林95杨的叶绿素a和叶绿素b含量，在Pb胁迫浓度低于600 mg·kg^-1时，南林95杨叶绿素a含量升高，叶绿素b含量下降，但叶绿素的总含量升高。当Pb胁迫浓度大于600 mg·kg^-1时，与对照组相比，南林95杨叶绿素a和叶绿素b含量均下降。南林95杨叶绿素a含量与对照组相比相差19.59%~-20.62%，叶绿素b含量与对照组相比少3.23%~27.10%。Pb-Cd复合胁迫下，Cd的加入抑制了Pb促进叶绿素a含量和叶绿素总含量升高的作用，叶绿素a含量与对照组相比相差5.00%~-28.89%，叶绿素b含量比对照组少3.41%~14.56%，但因Cd浓度较低，其影响不显著(F=0.25, P=0.63>0.05)。

图 5为不同浓度重金属胁迫下南林895杨的叶绿素a和叶绿素b含量。当Pb浓度为300 mg·kg^-1时，南林895杨叶绿素a含量与对照相比仅升高了3.04%。随着Pb浓度升高，南林895杨叶绿素a含量逐渐下降，与对照组相比最多降低24.33%；叶绿素b含量均比对照组低，最多降低68.09%；与南林95杨叶绿素a和叶绿素b与对照组相比的最大下降幅度多3.71%和40.99%。在Pb-Cd复合胁迫下，随着Pb-Cd浓度的升高，南林895杨叶绿素a和叶绿素b含量与对照组相比最多降低24.00%和38.30%，但随Cd的加入，当胁迫浓度为Pb 800 mg·kg^-1+Cd 1.6 mg·kg^-1和Pb 1 000 mg·kg^-1+Cd 2.0 mg·kg^-1时，叶绿素a和叶绿素b含量比Pb单一胁迫时高。同时与南林95杨相比，叶绿素a含量下降量仅少4.89%，叶绿素含量降低量多23.86%，由此说明，在Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫中，南林95杨比南林895杨表现出了更好的耐受性。

2.5 两种杨树对重金属胁迫的耐受性综合评价 2.5.1 主成分分析

对4个指标在不同胁迫浓度下的数值进行了主成分分析(表 1)。主成分1和主成分2的累计贡献率达77.96%，因此确定提取这2个成分，把原有的4个单项指标转换成2个综合指标。

2.5.2 综合分析

根据公式(1)~(5)求得综合评价结果如表 2所示。D值由提取的2个综合指标共同决定，反映2种杨树的综合耐受性，D值越大，耐受性越强^[12]。取不同浓度下综合评价值的平均值作为综合得分值，由表 2结果综合得分值可知，南林895杨的耐受性大于南林95杨。

3 讨论与结论

不同浓度Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫均降低了南林95杨和南林895杨的根系活力，这与HU et al^[19]的研究结果相似，但南林895杨的耐受性较南林95杨强。植物最早吸收Pb和Cd的器官在根部，在胁迫期间，根系细胞内会产生大量的活性氧自由基，从而增加了细胞膜的透性，导致细胞受损^[20]。Pb-Cd复合胁迫对杨树根系活力的影响更大，这可能是由于Pb和Cd之间存在相互协同促进作用，导致其对根系的毒性具有累加效应，但由于Cd的浓度较低，导致协同作用不明显。

植物在胁迫下可以快速激活抗氧化保护酶系统以减少活性氧物质的损害。在Pb胁迫下的南林95杨及在Pb-Cd复合胁迫下的南林895杨的CAT活性随胁迫浓度升高呈现先增加后减少的趋势，这符合植物对胁迫反应的典型特征，即当胁迫发生后，植物体会采取不同措施来适应逆境条件，但一旦胁迫时间过长或胁迫强度过高，超过植物所能承受的最大范围，其防御措施也就相应地减弱，乃至死亡^[21]。抗氧化保护酶是植物中活性氧防御系统重要的保护酶，但到达阈值后，也会出现降低趋势^[22]。在Pb-Cd的复合胁迫下，南林95杨CAT活性呈现逐渐下降趋势，原因是Cd的加入增强了Pb对南林95杨的胁迫作用，Cd加入后就已达到南林95杨的耐受阈值，而导致南林95杨CAT活性均低于对照组。在Pb胁迫下，Pb对于南林895杨的CAT活性影响较小，CAT活性趋于稳定，说明南林895杨的耐受性较南林95杨强。

在重金属胁迫下，植物细胞中可溶性蛋白质含量升高，一方面可以与重金属离子形成重金属结合蛋白，从而降低重金属对植物的毒性。另一方面，功能性蛋白质的增加，增大了细胞的渗透势，增强植物对重金属的抗性^[12]。在Pb胁迫下，南林95杨可溶性蛋白含量逐渐增加，但在Pb-Cd复合胁迫下，南林95杨可溶性蛋白质含量略低于对照组，与杨园等^[23]的研究结果基本一致，可能由于Cd高浓度时，干扰了植物体内的蛋白质代谢，使蛋白质的合成受阻，导致可溶性蛋白质减少；但在Pb-Cd复合胁迫下，南林895杨可溶性蛋白质含量高于对照组，说明可溶性蛋白质含量的变化差异与杨树的品种、重金属种类和胁迫的浓度有关^[24]。在Pb胁迫下，南林95杨的抗逆性优于南林895杨，在Pb-Cd复合胁迫中，南林895杨优于南林95杨，说明不同品种杨树对于不同金属的抗逆性有所差异。

在Pb胁迫浓度为300 mg·kg^-1时，南林895杨叶绿素含量升高，在Pb浓度大于300 mg·kg^-1时和Pb-Cd复合胁迫时均会降低叶绿素含量，说明低浓度胁迫能够促进植物体内与叶绿素有关的酶的合成，但仅比对照组高3.04%，所以不确定是Pb对其的促进作用，还是由于试验误差所导致，后续试验会作进一步的分析。叶绿素含量受胁迫的规律与原改换等^[25]的研究结果相似，在Pb-Cd复合胁迫下，Cd的加入使南林895杨叶片中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量整体均呈下降趋势，可能是Cd胁迫致使叶片中的铁含量下降，加上Cd自身对叶绿素新陈代谢的消极影响，导致叶绿素的降解和生物合成受到累加抑制^[26]，也有可能是叶绿体的超微结构受到破坏而影响合成叶绿素中几种酶(原叶绿素脂还原酶、δ-氨基乙酰丙酸合成酶和胆色素原脱氨酶)的正常构型，使这些酶的活性受到抑制，进而阻碍了叶绿素的合成^[27]。Pb胁迫下南林95杨的耐受性略强于南林895杨；Pb-Cd复合胁迫下，南林95杨比南林895杨所受的胁迫影响小，表现出了更好的抗逆性。这些差异特征可能并不是简单的相关关系^[28]，可能是由于重金属复合污染对植物的效应机理更复杂，不仅与植物吸收与运输以及测试指标敏感性有关，也与体内核酸、蛋白质、脂类，特别是酶等生物大分子的结合位点竞争影响有关^[29]，有待进一步研究。

在Pb胁迫和Pb-Cd复合胁迫下，南林895杨和南林95杨均表现出一定的耐受性，根据对2种杨树耐受性综合评价可知，南林895杨综合得分值大于南林95杨，南林895杨比南林95杨具有更好的抗逆性，具有更好的土壤重金属污染修复前景。