兰属(Cymbidium)隶属于兰科(Orchidaceae)树兰亚科(Epidendroideae)，全属约80种，皆列入濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)附录^[1]。中国是兰属植物的原产地，有近50种分布^[2]，同时也是兰属植物的主要栽培中心，有2 000多年的栽培历史。兰属植物俗称国兰，是中国传统十大名花之一，其叶形株型优美，花形态多变，具极高的保育、科研、观赏、生态和文化价值。

莲瓣兰(Cymbidium tortisepalum Fukuy.)和墨兰(C. sinense Willd.)是兰属的重要类群，是中国传统国兰栽培品种的两大类代表，深受中国、日本及东南亚人民的喜爱^[3]。莲瓣兰主要分布在云南、四川等地，生于海拔1 000~2 500 m光照适中的半阴混交林下及河谷地带^[2]，其株型和叶形优美，花色淡雅，花型变异最为丰富，是国兰栽培品种中奇花类的代表，在未来的园艺花卉产业等领域具有巨大的开发应用前景。墨兰主要分布在中国、日本及越南、缅甸等东南亚国家，生于海拔500~2 000 m的林下、灌丛或溪谷旁^[2]。墨兰花期10月至次年3月，又名报岁兰，其花香花色丰富，株型挺拔，花型多样，是国兰中的“年宵花之王”，是商业化和规模化生产最成功的国兰品种之一。

莲瓣兰和墨兰是兰属中花形态突变最为丰富的类群，是研究花形态变异及其遗传基础的良好材料^[4-5]。莲瓣兰和墨兰不仅存在雌雄器官正常发育的两性品种，而且存在雌雄器官分别败育和退化的单性品种，以及雌雄器官均退化的无性品种。这些材料是研究兰科植物性别分化非常宝贵的资源，对兰科植物性别决定和花器官发育的遗传基础及机理的解析具有重要意义，同时为培育新奇的国兰新品种提供重要的亲本来源和遗传资源。

兰属植物大多为二倍体，染色体数目为2n=2x=40^[6]。目前兰属植物的分子生物学和基因组学的研究尚处于起步阶段，一些重要的基础生物学信息尚不清楚。由于缺乏物种本身基因组的基本信息，其分子遗传学、基因组学及进一步的遗传育种的研究还相对滞后。作为保育、科研、及观赏价值较高的国兰品种，莲瓣兰和墨兰的相关研究更少。因此，要对国产兰属植物的细胞遗传学和分子生物学等进行研究，首先需要对其基因组的基本特征要有明确的认识。随着测序成本的大幅下降，对兰属植物进行全基因组测序已具有较好的开展条件。通过对其基因组大小进行测定，可提前预估其测序成本，并为其测序方法、组装策略的选择等提供重要的理论依据。

每种生物单倍体基因组的DNA总量称为C值(C value)。C值反映了物种本身DNA含量等基本遗传信息，与染色体核型的进化及物种生活史特征等存在一定的关联^[7]。C值不仅是该物种细胞遗传学研究的基础，同时也为其基因组和转录组学的研究提供本底资料。目前，对于兰属植物基因组DNA的C值含量和基因组大小评估的研究较少^[8]。本研究拟通过流式细胞技术对兰属中莲瓣兰和墨兰的基因组大小进行测定和分析，建立和优化基于流式细胞技术测定兰属植物基因组大小的测定方法和流程，从而为该属植物的细胞遗传学、分子生物学、基因组和转录组学的研究等提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料及仪器设备

试验材料莲瓣兰和墨兰的嫩叶均采自福建农林大学森林兰苑的兰科种质资源圃。试验所用内标——鸡红细胞核(chicken erythocyte nuclei，CEN，2.5 pg/2C)存于福建农林大学海峡联合研究院基因组与生物技术研究中心。试验所用到的主要试剂及仪器包括：Galbraith’s缓冲液^[9]、LB01缓冲液^[10]、碘化丙啶(PI)荧光染料、过滤膜(孔径30 μm)、培养皿(直径5 cm)、双面刀片、试管(10 mL)、Eppendorf管(1.5 mL)，及FACScalibur流式细胞测定仪(购自美国Becton-Dickinson, San Jose, CA公司)。

1.2 试验方法 1.2.1 解离液的选择与荧光染料的制备

为获得适合莲瓣兰和墨兰流式细胞测定的最佳解离液，分别利用Galbraith’s缓冲液和LB01缓冲液对两种植物的新鲜嫩叶进行裂解测试试验。细胞核荧光染料碘化丙啶(PI)具有非特异性标记作用，适合基因组的绝对值测量^[11]，使用的终浓度为50 μg ·mL^-1，保存于4 ℃冰箱中备用。在检测核DNA含量前，需排除RNA的干扰，因此在上机测定前需要预先使用RNAase(工作液浓度50~150 μg·mL^-1，贮存液1 mg·mL^-1，-20 ℃保存)降解RNA。

1.2.2 细胞核悬液的制备与细胞核染色

参考DOLEZEL et al^[11]的方法，进行细胞核悬液的制备与细胞核染色。分别称取莲瓣兰和墨兰的新鲜嫩叶各4份，每份约0.5 g，分别置于已加入1 mL预冷Galbraith’s或LB01缓冲液的培养皿中，并用锋利的双面刀片迅速切割将其快速切碎，使得细胞核游离出细胞。吸取培养皿中含有细胞核的裂解液于30 μm滤膜，过滤至1.5 mL Eppendorf管中。通过冷冻离心机800 r·min^-1离心5 min，弃掉上清，收集沉淀的细胞，再加入150 μL预冷解离液。将待测样品与对照标样鸡红细胞核(CEN)进行混合制样(等比例混匀)，吸取250 μL混合液，依次加入RNAase和0.5 μL预冷的碘化丙啶(PI)染料(终浓度100 μg·mL^-1)，置于4 ℃冰箱，避光孵育染色30 min后上机检测。

1.2.3 流式细胞仪检测和基因组大小估算

通过流式细胞测定染色的细胞核悬浮液的荧光强度，所用仪器为美国BD公司的FACScalibur流式细胞仪。上机前样品需要手动振荡5~10 s，通过扫描PI染色的1 000个悬浮的细胞核，检测其发射荧光强度(FL2-A)，每个样品重复4次。测定所得的图像和扫描的1 000个细胞核的测量数据由CellQuest软件(Becton-Dickinson, San Jose, CA)进行处理分析，获得莲瓣兰和墨兰测定样本及内标的G0/G1期的峰值。根据混合样品中鸡红细胞核(CEN)和待测样品的PI发射荧光强度的差异和峰值的相对关系，按照以下公式^[11]，即可分别计算出两种兰属植物基因组DNA含量：

待测样本的DNA含量/pg=CEN参考样本的DNA含量(pg)×$\frac{待测样本的G0/G1峰值位置}{\text{CEN参考的}G0/G1峰值位置}$

2 结果与分析 2.1 细胞核解离液和对照标品的选择

由于不同解离液对植物材料的解离效果具有差异^[12-17]，本研究以莲瓣兰和墨兰的嫩叶为试验材料，对常用的两种解离液(Galbraith’s缓冲液和LB01缓冲液)进行比较。结果发现Galbraith’s解离液对莲瓣兰和墨兰幼叶的解离效果最好，细胞核数目较多，LB01解离液的解离效果一般，细胞核数目较少。用鸡红细胞核作为对照标品(内标)分别与两种兰属植物的样品混合后进行流式细胞测定，发现测试样品与内标粒子的区分度较好，且无重叠峰，峰型清晰集中。因此用鸡红细胞核作为内标测定莲瓣兰和墨兰基因组大小具有合理性和准确性。

2.2 2C值和基因组大小的测定结果

以鸡红细胞核为内标，分别测定莲瓣兰与墨兰样品，结果如图 1和图 2所示。已有研究表明鸡红细胞核(CEN)的2C值为2.5 pg^[18]，本研究根据混合样品中CEN和待测样品的PI发射荧光强度的差异和峰值的相对关系，即可计算得出莲瓣兰基因组的2C值为(8.15±0.34) pg，墨兰基因组2C值为(8.34±0.36) pg(表 1)。从表 1中可知，莲瓣兰和墨兰的基因组DNA含量比较相近。为保证结果的可靠性，对每个物种进行4次生物学重复测量，以确保仪器测量的稳定性。此外，通过核DNA的含量换算(1 pg=0.978 Gbp)得出莲瓣兰的基因组大小为(3.98±0.17) Gbp，墨兰的基因组大小为(4.08±0.18) Gbp。

3 讨论与结论

目前，流式细胞技术已成为植物基因组大小测定的首选方法^{[11, 19]}，其优点在于测定结果精确、可重复性强、操作简便等，但用流式细胞仪测定植物基因组大小时，会出现同一物种不同试验材料的测定结果有所差异^{[11, 19]}，这可能与材料本身的自然变异有关，也可能与测试过程中的操作和测试条件等有关，因此在测试过程中应当充分考虑试验材料、裂解方法和内标选择等问题，把误差降到最小。

在流式细胞测定中，裂解液的选择至关重要，在对两种兰属植物的裂解试验中，发现Galbraith’s缓冲液的裂解效果最好，LB01缓冲液次之。这可能与Galbraith’s缓冲液中含有的染色质稳定剂氯化镁有关，其可保持含染色质的细胞核的稳定^[12]。同时，兰属植物叶肉细胞中含有大量的糖类、酚类等黏性物质，柠檬酸钠和TritonX-100等能清洗并减少此类杂质与细胞核粘连^[12]，降低了测定时信号的干扰。汪琛颖等^[8]以铁皮石斛(Dendrobium officinale Lindley)为内标，通过流式细胞技术测定出蕙兰(C. faberi Rolfe)2C值为8.98 pg。结果表明Galbraith’s缓冲液裂解的效果无论对于内标铁皮石斛或蕙兰均高于其它缓冲液，这与本文莲瓣兰和墨兰的测定结果是类似的。因此，对兰属物种进行流式细胞技术测定时，均可选择Galbraith’s缓冲液作为裂解液进行试验和测试。

在选择内标时，本文选用鸡红细胞核作为内标来测定两种兰属植物的C值，所用内标均为同一批标准样本。测定结果表明鸡红细胞核与兰属样品无重叠峰，区分度较好，保证了用鸡红细胞核作为内标估算两种兰属植物基因组大小结果的准确性。为了降低试验误差，测试材料均为活体植株新长出的幼小叶片。JONES et al^[20]通过流式细胞技术测定出墨兰的2C值为(6.31±0.21) pg，本试验测定结果为(8.34±0.36) pg。首先可以排除内标差异造成的结果不一致，因为两个试验体系所用的内标都为鸡红细胞核。其次，不同仪器间虽然会造成测试偏差，但一般不会有较大幅度的波动。有研究表明，同种植物在不同地理分布范围其基因组大小存在变异，这可能与当地环境适应有关^[21]。因此推测，造成两者差异的最可能原因是所选取的材料来源于不同的群体。这也提示我们在以后的研究中要对物种水平上的基因组大小进行评估，需要把不同居群间的差异考虑进去进行比较。

目前，兰科植物的细胞遗传学、分子生物学和组学的研究多集中在蝴蝶兰属(Phalaenopsis)、文心兰属(Oncidium)等传统洋兰品种，国产兰属植物的研究较少^[22]。作为保育、科研、及观赏价值较高的国兰品种，莲瓣兰和墨兰的相关研究更少。自2009年第一个兰科植物基因组——小兰屿蝴蝶兰(P. equestris (Schauer) Rchb. f.)的全基因组草图^[23]公布后，已有4种兰科植物的全基因组被破译和发表，分别为小兰屿蝴蝶兰^[24]、铁皮石斛^[25-26]、深圳拟兰(Apostasia shenzhenica Z. J. Liu & L. J. Chen)^[27]、天麻(Gastrodia elata Bl.)^[28]。兰科植物作为被子植物第二大科，其种类丰富，多样性极高，各类群全基因组序列的破译及进化基因组学的研究将为揭示兰科植的起源、进化及重要创新性状的遗传基础及其分子机理提供强大的基因工具包。本研究利用流式细胞技术，对兰属的莲瓣兰和墨兰的基因组大小的测定方法进行探索，并成功估测了莲瓣兰和墨兰的基因组大小。通过估测两种兰属植物的DNA含量，不仅为这两种兰属植物的全基因组测序工作的前期预算评估和后期组装结果矫正提供指导，也为该属植物的细胞遗传学、分子生物学、基因组和转录组学等研究提供理论基础。

致谢: 感谢美国弗吉尼亚梅森研究中心流式细胞和成像实验室的K. Arumuganathan博士在试验过程中提供的帮助。