干旱是影响植物生长的最主要因素之一, 对植物种子萌发^[1]、营养生长^[2-3]以及生殖发育^[4-5]具有广泛而深刻的影响, 严重制约森林植物群落的更新和演替进程。近年来, 多地通过栽培抗逆性强的树种对干旱区和石山区进行修复已成为国内外植物学和生态学研究领域的热点^[6-7]。柚木(Tectona grandis L.f.)为马鞭草科(Verbenaceae)柚木属(Tectona)的落叶或半落叶大乔木, 原产印度、缅甸、泰国和老挝等热带国家, 其树干圆满通直, 心材比率大, 木材坚韧耐久、不易变形、极耐腐, 是世界公认的最优质珍贵的木材之一^[8-9]。同时, 柚木具抗逆性强、生长较快、适应性强等特性, 又是优良的山地造林树种^[10-11]。近年来, 柚木在广西石山区发展呈现良好的前景, 对当地的植被恢复和生态重建发挥重要作用^[12]。然而随着全球气候变暖以及我国降水格局的变化, 石山区内频繁的季节性干旱在一定程度上限制了柚木的生长。因此, 开展柚木抗旱性研究, 探索增强其抗旱性和适应性的方法对石山区生态系统的植被恢复和重建具有重要意义。

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是一类能与80%陆生植物形成互惠共生体的土壤真菌^[13-16]。它能提高土壤通过根系输送给植物叶片的水量, 从而提高植物在干旱条件下的生存能力^[17-18]。光合作用和叶绿素荧光动力学参数对干旱胁迫都特别敏感, 是衡量干旱胁迫条件下植物受伤害程度的重要指标^[19-20]。干旱胁迫条件下, 植物体内会发生一系列生理生化反应, 造成植物气孔关闭, 叶绿体活性降低, 从而影响电子传递、光合磷酸化及暗反应, 最终导致植物的光合速率降低^[21]。大量研究表明, 光合作用参数能够直观地反映干旱胁迫对植物生理过程的影响, 而叶绿体荧光参数能够具体反映环境胁迫度对光合系统内部变化的影响, 这些参数对反映植物内在与外界环境的关系具有重要的生物学意义^{[3, 22]}。本研究旨在通过测定接种AMF的柚木在不同干旱胁迫条件下叶片光合作用及荧光参数的变化, 初步探讨AMF提高柚木抗旱性的机制, 以期为石山区生态系统的植被恢复和重建提供科学依据。

试验区位于南宁市北郊广西壮族自治区林业科学研究院试验苗圃, 海拔85 m, 属典型的南亚热带季风气候, 温和湿润, 阳光充足, 雨量充沛, 夏长冬短。该地年平均日照时间约1 550 h, 极端最高气温40.4 ℃, 极端最低气温-2.1 ℃, 年平均气温约21.5 ℃, 年平均降雨量1 304.2 mm, 年平均自然蒸发量1 397 mm, 年平均相对湿度79%。

供试菌种购买于北京市农林科学院植物营养与资源研究所, 2个摩西球囊霉菌种(Glomus. mosseae, GM：编号BGC HUN03B, 分离于湖南郴州；编号BGC XJ08A, 分离于新疆轮台)和2个幼套球囊霉菌种(Glomus. etunicatum, GE：编号BGC HEB04, 分离于河北廊坊；编号：BGC XJ04B, 分离于新疆沙湾), 共4个菌种。供试柚木种子为中国林业科学研究院热带林业实验中心提供, 经处理后采用灭菌沙床催芽, 长成芽苗后进行不同菌种接种移植, 单株培养, 基质袋规格为20 cm×20 cm, 基质为草炭土:珍珠岩:沙(7:2:1)。

试验分4个菌种(HUN03B、XJ08A、HEB04、XJ04B)接种处理, 未接种苗木作为对照(CK), 每个处理6次重复, 共计30盆。接种40 d后对柚木根系进行菌根真菌浸染检测, 接种半年后进行干旱胁迫处理及菌根依赖性(mycorrhizal dependency, MD)指数测定。

菌根真菌浸染检测：分处理对柚木根系进行取样, 取样时以苗木根颈为中心, 切取对称两侧距离苗木根颈5 cm以外、宽3~4 cm的基质块, 从切取的基质块中选取切断的根系剪成1 cm长, 用标准固定液(formaldehyde acetate and alcohol, FAA)保存一段时间后, 按照墨水醋染色法^[23]染色制片, 采用Olympus CX-41型光学显微镜对菌根真菌侵染情况进行观察、记录并拍照。菌根浸染率/%=浸染根段数量/检测根段总数量×100。干旱胁迫处理：干旱胁迫分正常水分、干旱5 d和干旱10 d三种水分条件, 其中, 正常水分, 以柚木轻基质杯苗木常规管护为标准, 早晚各浇透水1次；干旱胁迫5 d, 为完全不淋水5 d；干旱胁迫10 d, 为完全不淋水10 d。分别在3个不同的时间节点选取每盆苗木树冠中上部成熟叶片, 采用Li-6400XT便携式光合分析仪和FMS-2便携式叶绿素荧光仪(F_v/F_m模式)进行光合作用及荧光参数测定, 同一个时间节点不重复使用同一片树叶进行两者的测定。MD测定：干旱胁迫试验后, 分处理、分根茎叶对所有苗木生物量进行测定, 洗净吸干表面水分, 105 ℃杀青5 min, 60~80 ℃烘干至恒重, 分别称取重量, 三部分之和为总生物量。MD/%=接菌后植物生物量(M+)/未接菌植物生物量(M-)×100。

应用Excel 2010软件对试验数据进行常规统计和作图, 应用SPSS 19.0统计分析软件对相关数据进行方差分析, 并用邓肯氏新复极差法(Duncan′s)进行多重比较, 显著性水平均设定为α=0.05。

AMF对根系的浸染效果与植物种类^{[16, 24]}、土壤pH值^[4]、土壤养分含量^[15]、土壤含水量^[7]及土壤脱氢酶活性^[7]、脲酶^[15]、过氧化氢酶等^[25]均相关。这些指标能影响AMF的浸染率。如图 1所示, GM和GE两种真菌均能很好地浸染柚木根系, 形成明显的丛枝菌根结构。形成的丛枝随着时间的推移, 形状变大变粗, 泡囊结构也不断变化。4种菌种中, 以接种XJ04B浸染柚木根系效果最好, 菌根浸染率可达98%, 接种40 d便已形成丰富的菌根结构[图 1(D)]。

	注：A.未接种无菌根结构；B.接种AMF形成泡囊；C.GM侵染效果；D.GE浸染效果。 Note:A. non-mycorrhizal structures of the non-AMF treatment; B. vesicule after the AMF treatment; C. infection of GM fungi; D. infection of GE fungi. 图 1 丛枝菌根真菌浸染柚木根系形成的菌根结构 Fig. 1 Mycorrhizal structures in T. grandis roots infected by AMF
图选项

根据NEMEC^[26]的分类方法, 将植物对菌根的依赖程度分为3级：当MD≥300%时, 为高强度依赖；300%＞MD≥200%时, 为中等强度依赖；200%＞MD≥100%时, 为弱依赖或无依赖。由表 1可知, 4种不同菌种接种处理下柚木苗木的MD稍有不同, MD在173%~223%之间, 其中接种XJ08A菌种的柚木苗木MD最小, 其次是接种HUN03B和HEB04菌种, 接种以上3种菌种的柚木苗木MD均为弱依赖, 接种XJ04B菌种的柚木苗木MD最大, 为中等强度依赖。

正常水分条件下, 接种处理的柚木叶片净光合速率(net photosynthetic rate, P_n)值均高于CK, 其中HUN03B、XJ04B、XJ08A菌种接种处理间差异达到显著水平(P＜0.05)；干旱胁迫5 d和干旱胁迫10 d时, 接种处理的柚木叶片P_n值均显著高于CK[图 2(a)]。随着干旱程度的加剧, CK的柚木叶片P_n逐渐变小, 干旱胁迫10 d时, 柚木叶片P_n值由最初的6.305 μmol·m^-2·s^-1降至0.073 μmol·m^-2·s^-1。接种处理的柚木叶片P_n值则呈现不同的变化：HUN03B和HEB04菌种接种处理的柚木叶片P_n值呈先增后减的变化趋势；XJ08A菌种接种处理的柚木叶片P_n值随干旱胁迫的加剧逐渐减小；XJ04B菌种接种处理的柚木叶片P_n值呈先减小后略增的变化趋势。其中以正常水分条件下XJ04B菌种接种处理的柚木叶片P_n值最大, 达10.073 μmol·m^-2·s^-1。

	注：图中每个区组中不同字母代表处理间达显著性差异(P＜0.05)。 Note: different letters in each block represent significant differences as determined by Duncan′s test at 0.05 level (P < 0.05). 图 2 不同菌种接种处理的柚木叶片光合参数 Fig. 2 Inoculation of AMF on photosynthetic parameters of T. grandis seedling leaves under different drought stress conditions
图选项

正常水分条件下, 接种处理的柚木叶片气孔导度(stomatal conductance, G_s)值均高于CK, 其中HUN03B、HEB04菌种接种处理间差异达到显著水平；干旱胁迫5 d和干旱胁迫10 d时, 接种处理的柚木叶片G_s值均显著高于CK[图 2(b)]。随着干旱程度的加剧, 接种处理间的柚木叶片G_s值差异逐渐变小。干旱胁迫5 d和干旱胁迫10 d时, XJ04B菌种接种处理的柚木叶片G_s值均最大, 分别为0.264和0.111 mol·m^-2·s^-1, 显著高于其他3个接种处理。

在正常水分、干旱胁迫5 d、干旱胁迫10 d三种水分状况下, CK的柚木叶片胞间CO₂浓度(intercellular CO₂ concentration, C_i)均为最高值, 分别为321.928、295.455和348.319 μmol·mol^-1[图 2(c)]。随着干旱胁迫的加剧, HUN03B、HEB04、XJ04B菌种接种处理的柚木叶片C_i值呈先增后减的趋势, XJ08A菌种接种处理的柚木叶片C_i值呈逐渐递减的趋势, CK的柚木叶片C_i值呈先减后增的趋势。干旱胁迫10 d时, CK的柚木叶片C_i值(348.319 μmol·mol^-1)显著高于各接种处理的C_i值(207.904~231.538 μmol·mol^-1)。

随着干旱胁迫的加剧, 各处理的柚木叶片蒸腾速率(transpiration rate, T_r)变化趋势也各异：HUN03B和HEB04菌种接种处理的柚木叶片T_r值呈逐渐减小的趋势；XJ08A和XJ04B菌种接种处理的柚木叶片T_r值呈先增后减的趋势；CK的柚木叶片T_r值呈逐渐减小的趋势[图 2(d)]。正常水分条件下, HEB04菌种接种处理的柚木叶片T_r值最大, 为8.402 mmol·m^-2·s^-1。干旱胁迫条件下, CK的柚木叶片T_r值均显著低于4个接种处理。干旱5 d和干旱10 d均以XJ04B菌种接种处理的柚木叶片T_r值最大, 分别为7.683和4.791 mmol·m^-2·s^-1, 而同期CK柚木叶片的T_r值分别为3.501和0.323 mmol·m^-2·s^-1。

在正常水分、干旱胁迫5 d、干旱胁迫10 d三种水分状况下, 柚木叶片的水分利用效率(water use efficiency, WUE)各不相同：在正常水分条件时, HUN03B与HEB04菌种接种处理的柚木叶片WUE值低于CK, 而XJ08A与XJ04B菌种接种处理的柚木叶片WUE值则高于CK[图 2(e)]。随着干旱的加剧, CK的柚木叶片WUE逐渐下降, 干旱胁迫5 d时, WUE值为1.045 μmol·mmol^-1, 显著低于XJ08A和HEB04菌种接种处理, 干旱胁迫10 d时, WUE值仅为0.332 μmol·mmol^-1, 显著低于4个接种处理。

叶绿素荧光动力学参数能反映光系统Ⅱ对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面的状况, 是探究光合机构效能及其与环境胁迫关系的重要依据^[19-20]。初始荧光(original fluroescence, F_o)表示PSⅡ反应中心处于完全开放时的荧光产量, 又称为最小荧光产量、固定荧光, 与叶片叶绿素浓度有关^{[19, 27]}。随着干旱胁迫的加剧, 相同处理的F_o值均呈增加趋势, 其中CK的增加最多。干旱胁迫10 d时, CK的F_o值最大, 达211, 其他处理的F_o值均在200以内；干旱胁迫5 d和干旱胁迫10 d时, 不同处理间的F_o值差异均未达到显著水平[图 3(a)]。最大荧光(maximum fluroescence, F_m)表示PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量^{[19, 27]}。F_m值变化趋势跟F_o值刚好相反：随着干旱胁迫的加剧, 接种处理的F_m值均下降, CK的F_m值略微增加。干旱胁迫5 d时, 4个接种处理的F_m值均显著高于CK, 其中HEB04菌种接种处理的F_m值最大, 为1 121。干旱胁迫10 d时, 接种处理和CK间的F_m值差异不显著, 以XJ04B菌种接种处理的F_m值最大, 为867 [图 3(b)]。可变荧光(variable fluroescence, F_v, F_v=F_m-F_o)为最大荧光与初始荧光的差值^{[19, 27]}。随着干旱胁迫的加剧, 各处理F_v值的变化趋势基本与F_m值一致。干旱胁迫5 d时, 4个接种处理F_v值均显著高于CK, 其中HEB04菌种接种处理的F_v值最大, 为933。干旱胁迫10 d时, 接种处理和CK间F_v值差异不显著, 以XJ04B菌种接种处理的F_v值最大, 为679 [图 3(c)]。PSⅡ最大光化学效率(F_v/F_m)是衡量植物是否受到胁迫的重要指标, 在非胁迫条件下, 该参数变化极小, 不受物种和生长条件的影响, 恒定在0.875左右, 当植物遭受胁迫时, 该参数会明显降低, 胁迫越严重, 值越低^[27]。从[图 3(d)]可知, 随着胁迫时间和胁迫程度的加剧, 各处理的F_v/F_m值均明显下降。干旱胁迫5 d和干旱胁迫10 d的接种处理的F_v/F_m值均显著高于CK。干旱胁迫5 d时, 4个接种处理的F_v/F_m值维持在0.807~0.832之间, 而此时CK的F_v/F_m值为0.755, 显著低于接种处理；干旱胁迫10 d时, 仍以CK的F_v/F_m值最低, 为0.736, 此时, 接种处理的F_v/F_m值均明显降低, 在0.750~0.783之间, 略高于CK, 但与其差异不显著。

	注：图中每个区组中不同字母代表处理间达差异性显著(P＜0.05)。 Note: means with different letters in each block represent significant differences as determined by Duncan′s test at 0.05 level (P < 0.05). 图 3 不同菌种接种处理的柚木叶片荧光参数 Fig. 3 Inoculation of AMF on fluorescence parameters of T. grandis seedlings leaves under different drought stress conditions
图选项

大量研究结果表明^[15-18], 宿主植物和AMF之间存在依赖性和选择性。不同植物对菌根的依赖性有很大差异, 同一植物对不同真菌的选择性也存在很大差异。本研究中, 柚木对不同菌种的MD也不相同, 对XJ04B菌种的MD为中等强度依赖, 对其他3个菌种为弱依赖。这与弓明钦等^[28]对柚木菌根研究中提到的不同菌种对不同柚木无性系人工接种的效果不一致的研究结论相类似。总的来说, 柚木是一种菌根营养型树种, 接种AMF对苗木生物量积累有促进作用。

植物叶片P_n降低的因素主要为气孔部分关闭导致的气孔限制和叶肉细胞光合活性下降导致的非气孔限制两类^[29]。本试验中, 随着干旱胁迫的加剧, 未接种处理的P_n一直呈下降趋势, 而它的C_i呈先下降再上升的变化, 说明干旱对未接种处理苗木的影响由气孔限制转变为非气孔限制, 即对其光合结构造成了一定的伤害, 光合系统受损。与此同时, 接种处理的P_n值呈现下降趋势(HUN03B与HEB04菌种呈先上升后下降趋势), C_i值呈下降(或先升后降)的变化趋势, 说明干旱对接种处理苗木的影响仅为气孔限制。同时也表明AMF与柚木共生减缓了光合系统内部的损伤程度, 保持了高的光能利用效率。

叶绿素荧光参数指标同样印证了这一点, 在干旱胁迫环境中, F_v/F_m降低的同时若伴随有F_o的升高, 则可明确PSⅡ反应中心已经遭到破坏^[30]。本试验中, 干旱胁迫5 d和干旱胁迫10 d中CK的柚木F_v/F_m值均低于接种处理, 且F_o升高, 表明其PSⅡ反应中心遭到破坏, 部分失活^[27]。同时, 说明接种AMF对柚木叶片PSⅡ反应中心具有一定的保护作用, 减轻了干旱胁迫条件下柚木受伤害和光抑制的程度, 其中以接种XJ04B菌种PSⅡ反应中心受损最小, 与试验中光合作用的变化基本一致。这与LIU et al^[31]对杂交杨和OYETUNJI et al^[32]对木薯的研究结论相似。

菌根化苗木根系外围有丰富的菌丝网络, 一方面菌丝可以延伸至根系无法伸入的岩石缝隙帮助增加苗木根系水分吸收范围和水量^[6], 另一方面AMF与宿主植物共生后可通过调控基因表达^{[4, 15]}和调节内源激素^[25]等方式来提高植物的抗旱性。例如通过调控基因表达关闭气孔, 减少蒸腾；积累更多的可溶性糖和脯氨酸含量来提高渗透势, 增加根系的吸水能力；产生细胞分裂素等许多內源激素, 提高宿主植物脱落酸水平, 促进叶片气孔关闭, 减少叶片水分损失等。这些对石漠化造林中提高苗木成活率有非常高的应用意义^[6-7]。同时, AMF提高宿主植物抗旱性的程度与浸染率^[24]、孢子密度^[4]]、土壤有机质含量^[15]、水分含量^[7]、土地耕作方式^[15]、种植方式^[16]、施肥方式^[15]等都有着密切的关系^{[2, 27]}, 需要进行系统的研究。因此, 加大加深应用AMF在石漠化造林苗木上的研究迫切而有价值。