文章信息
- 李文杨, 李永生, 曹亚兵, 王哲, 闫丽君, 范国强
- LI Wenyang, LI Yongsheng, CAO Yabing, WANG Zhe, YAN Lijun, FAN Guoqiang
- 泡桐丛枝病相关lncRNAs的表达和调控
- Expression and regulation of lncRNAs related to Paulownia witches' broom
- 森林与环境学报,2019, 39(2): 181-187.
- Journal of Forest and Environment,2019, 39(2): 181-187.
- http://dx.doi.org/10.13324/j.cnki.jfcf.2019.02.010
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文章历史
- 收稿日期: 2018-05-31
- 修回日期: 2018-09-25
2. 河南农业大学泡桐研究所, 河南 郑州 450002
2. Institute of Paulownia, Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan 450002, China
植原体(Phytop lasma)原称类菌原体, 是一类重要植物病原微生物,常引起植物丛枝、黄化、花变叶、节间变短、矮化等症状,给农、林业种植造成巨大的经济损失。泡桐属(Paulownia Sieb. et Zucc.)原产于中国,现已在世界各地广泛分布,是重要的园林绿化和速生用材优良树种,而由植原体引起的泡桐丛枝病(Paulownia witches′ broom,PaWB)是危害泡桐栽培和生产最严重病害之一,可导致幼树生长缓慢或死亡、成龄树木的木材品质下降,其在自然界可通过昆虫的传播而大面积扩散[1-3]。范国强等[4]发现,100 mg·L-1的利福平可使感染泡桐丛枝病的泡桐苗恢复正常形态。
长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200 nt的非编码RNA,存在较高的时空特异性和组织特异性,在生物生长、发育和胁迫反应中具有重要作用[5-8]。植原体目前仍不能进行人工离体培养,阻碍了病原菌分子生物学的深入研究,许多受丛枝病危害的植物,如枣树(Ziziphus jujuba Mill.)、樱桃(Cerasus pseudocerasus G. Don)、竹子(Bambusoideae)、绣线菊(Spiraea×bumalda cv. Goldmound)、黄蒿(Artemisia scoparia waldst.et Kit)等的研究还多集中在病原物的分子鉴定[9-13],与丛枝病相关的lncRNA研究较少[14]。利用高通量测序平台建立泡桐健康苗、泡桐丛枝植原体感染的泡桐病苗和利福平处理的泡桐丛枝病苗的lncRNAs文库,寻找与泡桐丛枝病相关的lncRNAs,并探讨其调控机制,为泡桐丛枝病的发生机理奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料以河南农业大学林木生物技术实验室培养的毛泡桐[Paulownia tomentosa (Thunb.) Steud.]健康苗和植原体感染的泡桐丛枝病苗为试验材料,在温度为(25±2) ℃,光照度为130 μmol·m-2·s-1,光照周期为16 h/8 h (光/暗)条件下培养。30 d后,取长势均匀, 长度约1. 5 cm的泡桐丛枝病苗的顶芽接种于盛有50 mL含100 mg·L-1利福平的1/2 MS培养基(100 mL三角瓶)中进行利福平处理(PTIL-100), 同时将泡桐健康苗和丛枝病苗的顶芽分别转入不含利福平的1/2 MS培养基中培养,分别命名为PT和PTI。每个三角瓶中培养3个外植体,每个样品培养30瓶,PT、PTI和PTIL-100的幼苗培养30 d后,分别剪取顶芽,用液氮速冻后-80 ℃冰箱冷藏,为总RNA的提取做准备。
1.2 构建lncRNAs文库样品总RNA的提取使用TRLzol试剂, 参照试剂盒使用说明书进行,使用Agilent 2100生物分析仪和NanoDrop 2000超微量分光光度计进行质量检测。按照TruSeq Stranded标准进行RNA-Seq文库的构建,并使用Illumina HiseqTM 2000平台进行测序,得到的原始数据经碱基识别分析转化raw reads,将测序得到的raw reads去除含adapter、含N和低质量的reads,最终得到clean reads。利用SOAP2 (-m 0-x 1000-s 40-l 32-v 5-r 2)比对核糖体RNA数据库,去除含有rRNA的reads。使用转录组数据比对软件TopHat (v2.0.10), 将clean reads比对(--coverage-search-p 6--phred64-quals--segment-length 30--segment-mismatches 2-r 20--library-type fr-firststrand)到泡桐参考基因组上进行分析。
1.3 lncRNAs的鉴定与分类用cufflinks (v2.2.1参数-F 0.3-j 1-A 0-p 6--library-type fr-firststrand)对reads进行组装,组装后过滤百万外显子的碱基片段(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped,FPKM)较低和剩余长度小于200 bp的序列,用cuffcompare将这些转录本与已知的mRNA进行比较,得到的novel转录本经过Coding Poteintial Calculator (cpc-0.9-r2),蛋白质家族数据库Pfam,Coding-Non-Coding Index编码潜力预测得到PT、PTI和PTIL-100的候选lncRNAs。用cuffmerge整合PT、PTI和PTIL-100的lncRNAs预测结果,根据已鉴定的lncRNAs在泡桐基因组染色体上的分布情况,对lncRNAs进行分类[15]。为了更直观的展示lncRNAs在染色体中分布情况,采用circos (ww.circos.ca)软件进行泡桐基因组作图。
1.4 lncRNAs功能预测lncRNAs顺式调控靶基因主要根据位置关系预测,定义染色体中上、下游10 kb范围内存在差异表达的lncRNAs与差异表达的mRNA。lncRNAs反式调控,利用RNAplex的ViennaRNA包,根据其热力学结构, 计算最小自由能, 预测最佳lncRNA-mRNA配对关系。
1.5 差异表达lncRNAs的筛选用cuffdiff计算lncRNAs和基因在PT、PTI和PTIL-100中的表达量(FPKM值),负二项分布模型检测样本间的差异程度,并从结果中筛选真正有显著差异的lncRNAs和基因(筛选条件为P≤0.01)。寻找与泡桐丛枝病相关的lncRNAs,步骤如下: (1)在丛枝病苗和利福平处理后恢复健康形态的泡桐苗建立的文库之间(PTI/PTIL-100)筛选出来的差异lncRNAs,可能受到泡桐丛枝病和利福平及泡桐生长发育变化的影响而差异表达;(2)在健康泡桐苗与利福平处理后恢复健康形态的泡桐苗建立的文库中比较(PT/PTIL-100),筛选出非差异表达的lncRNAs,这些lncRNAs可能受到泡桐生长发育的影响;(3)是在(1)和(2)筛选出的lncRNAs中寻找差异表达的lncRNAs,排除受到利福平处理影响而差异表达的lncRNAs;(4) PT/PTI中筛选出可能是受到泡桐丛枝病和泡桐生长发育变化的影响而差异表达的lncRNAs;(5)是在(3)和(4)中比较,筛选出相同的lncRNAs,这可能就是直接与泡桐丛枝病密切相关的lncRNAs。
1.6 GO功能和Pathway显著性富集分析对PT、PTI和PTIL-100中差异表达的lncRNAs的靶基因进行基因本体论(gene ontology,GO)功能分类和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)生物学途径分析。
1.7 qRT-PCR验证随机挑选测序结果中的lncRNAs和候选靶基因进行qRT-PCR验证。总RNA提取方法参照1.2的方法,需要验证的lncRNAs和靶基因利用Primer Express 3.0 (Applied Biosystems,Stockholm,Sweden)设计引物(表 1),用iScriptTM cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录合成cDNA的第1条链,使用Taq SYBR© Green qPCR Premix试剂在荧光定量PCR仪(CFX96TM Real-Time System)进行qRT-PCR验证。每个样品重复3次。以18S rRNA为内参,根据相对定量方法(2^-△△Ct法) [16]对实验结果进行定量分析。
类别Class | 正向引物Forward primer(5′-3′) | 反向引物Reverse primer(5′-3′) |
TCONS_00019908(lncRNA) | GCCCAACCAAGAATCTAA | TTCCACTAATCCACCTGT |
TCONS_00021677(靶基因) | CCTCATTAGCATCTCCAAT | GCAACTTCTTCTGTCATAAC |
PAU002322.1 | CACGGCATTCTATCAACT | GATGAGAGAGCCATTGTT |
PAU012048.1 | GAGCAAGAATTGTGAATGTC | GAGTGTCTATATCTCCAAGTTC |
利用高通量测序平台对PT、PTI和PTIL-100进行测序,共获得80 949 026 (PT)、80 453 898 (PTI)和80 314 814 (PTIL-100)个clean reads,去除含有rRNA的reads,参考泡桐基因组进行转录本组装,过滤FPKM和覆盖度较低的序列,并对单个样品的候选lncRNAs进行预测,并将PT、PTI和PTIL-100的lncRNAs用cuffmerge整合到一起,鉴定得到3 237个候选lncRNAs和50 974个mRNAs。依据lncRNAs在基因组上的位置可分为4类:81.90%“u”, 14.86%“x”, 1.17%“j”和2.07%“o”,显示大部分泡桐的lncRNAs存在于基因间区。分别对mRNAs和lncRNAs的长度和exon个数进行统计。结果显示:67.07%的lncRNAs的长度在300~1 000 nt,99.91%的lncRNAs的exon个数在10以内;49.98%的mRNAs的长度大于1 500 nt,21.44%的mRNAs的exon个数大于或等于20。PT、PTI和PTIL-100的lncRNA在染色体中分布情况见图 1。
2.2 lncRNAs功能分析为更好地了解lncRNAs的功能,对其靶基因进行了预测。结果表明:PT、PTI和PTIL-100鉴定得到的lncRNAs中有1 826个lncRNAs有靶基因,这些lncRNAs对应1 523个靶基因,其中1 505个靶基因认为是1 808个lncRNAs的顺式调控基因,18个靶基因被认为是18个lncRNAs的反式调控基因。
2.3 差异表达的lncRNAs分析基于FPKM和P≤0.01的条件,从鉴定出的3 237个候选lncRNAs筛选出2 894个lncRNAs,其中PT中含有2 633个lncRNAs,PTI文库中含有2 698个lncRNAs,PTI中含有2 740个lncRNAs。3个文库的lncRNAs比较,发现有2 383个相同的lncRNAs,PT中含有79个独特的lncRNAs,PTI含有9个独特的lncRNAs,PTIL-100含有12个独特的lncRNAs。PT、PTI和PTIL-100之间两两比较分析差异表达的lncRNAs和mRNAs。结果发现:PT/PTI中鉴定出210个差异表达的lncRNAs (121个上调,89个下调),985个差异表达的mRNAs (802个上调,183个下调);PT/PTIL-100中鉴定出208个差异表达的lncRNAs (129个上调,79个下调),1 064个差异表达的mRNAs (817个上调,247个下调);PTI/PTIL-100中鉴定出35个差异表达的lncRNAs (17个上调,18个下调),396个差异表达的mRNAs (153个上调,243个下调)。对PT、PTI和PTIL-100两两比较中差异表达的lncRNAs取并集,发现3个文库中共同的差异表达的lncRNAs有147个。
2.4 差异表达lncRNAs的靶基因GO功能和Pathway显著性富集分析147个差异表达的lncRNAs中有79个lncRNAs预测有靶基因,lncRNAs对应的候选靶基因有157个,通过GO功能分析确定靶基因行使的主要生物学功能。结果发现:显著性富集的GO条目有40个,主要包括生物过程(代谢过程和细胞过程)、细胞成分(细胞、细胞器和膜及其组成成分)和分子功能(结合活性、催化活性)。差异表达的lncRNAs的靶基因显著性富集参与了119条代谢通路,包括氨基酸的代谢、玉米素的生物合成、RNA转运、硫锌酸代谢等(表 2)。
代谢通路 Pathway |
基因数目 Gene number |
P值 P value |
代谢通路ID Pathway ID |
氰氨基酸代谢Cyanoamino acid metabolism | 4 | 0.010 540 | ko00460 |
安沙霉素类的生物合成Ansamycins biosynthesis | 1 | 0.014 458 | ko01051 |
阿米巴病Amoebiasis | 2 | 0.021 258 | ko05146 |
乙醛酸和二羧酸盐代谢Glyoxylate and dicarboxylate metabolism | 3 | 0.022 105 | ko00630 |
赖氨酸生物合成Lysine biosynthesis | 2 | 0.028 400 | ko00300 |
阿尔茨海默病Alzheimer′s disease | 4 | 0.033 884 | ko05010 |
玉米素生物合成Zeatin biosynthesis | 3 | 0.038 881 | ko00908 |
RNA转运RNA transport | 8 | 0.048 291 | ko03013 |
硫辛酸代谢Lipoic acid metabolism | 1 | 0.051 087 | ko00785 |
Wnt信号通路Wnt signal pathway | 3 | 0.061 972 | ko04310 |
内吞作用Endocytosis | 7 | 0.065 466 | ko04144 |
甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢Glycine, serine and threonine metabolism | 3 | 0.086 174 | ko00260 |
碳水化合物消化吸收Carbohydrate digestion and absorption | 1 | 0.091 681 | ko04973 |
脂肪酸生物合成Fatty acid biosynthesis | 2 | 0.095 874 | ko00061 |
抗原处理与表达Antigen processing and presentation | 2 | 0.097 677 | ko04612 |
维生素消化吸收Vitamin digestion and absorption | 1 | 0.099 591 | ko04977 |
沙门氏菌感染Salmonella infection | 2 | 0.104 987 | ko05132 |
哺乳动物的昼夜节律Mammals′ circadian rhythm | 1 | 0.107 433 | ko04710 |
非同源末端连接Non-homologous end-joining | 1 | 0.110 032 | ko03450 |
帕金森病Parkinson′s disease | 2 | 0.121 943 | ko05012 |
比较差异表达的lncRNAs,寻找可能与泡桐丛枝病密切相关的lncRNAs。PTI/ PTIL-100中比较出35个差异表达的lncRNAs,与PT/PTIL-100中筛选出2 686个非差异表达的lncRNAs进行差异性比较,排除受到利福平影响而差异表达的lncRNAs,结果得到2 657个差异表达的lncRNAs, 这些lncRNAs再与PT/PTI中差异表达的lncRNAs比较,筛选出相同的lncRNAs,最后获得72个lncRNAs可能与泡桐丛枝病发生密切相关。72个lncRNAs中37个lncRNAs预测有靶基因,其中在Nr数据库有功能注释的有33个(表 3),共参与12条KEGG代谢通路,分别为磷脂酶D信号通路、Wnt信号通路、RNA转运、ABC转运、糖基磷脂酰肌醇(GPI) -锚定生物合成途径、核糖体的生物合成、次生代谢产物的生物合成、内吞作用、泛素介导的蛋白水解、玉米素生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。
长链非编码RNA lncRNA | 靶基因Target gene | Nr数据库注释Nr-annotation |
TCONS00015345 | PAU013800.1 | 未知蛋白LOC105178025 Unidentified protein LOC105178025 |
TCONS00001966 | PAU001903.1 | 假定蛋白质MIMGUmgv1a003068 mg Hypothetical protein MIMGUmgv1a003068 mg |
TCONS00031175 | PAU028211.1 | WD重复蛋白11 WD repeat protein 11 |
TCONS00005867 | PAU005253.1 | 核孔复合蛋白NUP1-like Nuclear pore complex protein NUP1-like |
TCONS00008181 | PAU007311.1 | tRNA-dihydrouridine (20a/20b) synthase [NAD(P)+]-like isoform X2合酶[NAD(P)+]-like类异构体X2tRNA二氢尿苷(20a/20b) |
TCONS00008211 | PAU007368.1 | 早老素样蛋白At2g29900 Presenilin-like protein At2g29900 |
TCONS00011647 | PAU010501.1 | 锯齿状RNA效应分子类似物Serrate molecular analogues of RNA effector |
TCONS00014196 | PAU012755.1 | 含NAC结构域样蛋白78 NAC domain-containing protein 78-like |
TCONS00016631 | PAU014963.1 | ABC转运样蛋白G家族成员12 ABC transporter G family member 12-like |
TCONS00020602 | PAU018575.1 | DNA /RNA结合蛋白KIN17 DNA/RNA-binding protein KIN17 |
TCONS00023638 | PAU021365.1 | 环H2指蛋白ATL78-like Ring-H2 finger protein ATL78-like |
TCONS00024786 | PAU022405.1 | U3小核仁RNA相关蛋白25 U3 small nucleolar RNA-associated protein 25 |
TCONS00029461 | PAU026673.1 | 核苷抗坏血酸转运体1 Nucleobase-ascorbate transporter 1 |
TCONS00002512 | TCONS00003863 | 多聚蛋白Polyprotein |
TCONS00002800 | TCONS00004283 | 核基质成分样蛋白1 Putative nuclear matrix constituent protein 1-like protein |
TCONS00008839 | TCONS00013553 | 可能亚油酸9S脂氧合酶7,部分Probable linoleate 9S-lipoxygenase 7, partial |
TCONS00010031 | TCONS00015267 | Ras相关蛋白RABG3d Ras-related protein RABG3d |
TCONS00010648 | TCONS00016309 | 未知蛋白LOC105164324 Uncharacterized protein LOC105164324 |
TCONS00012917 | TCONS00019573 | SKP1-like蛋白12 SKP1-like protein 12 |
TCONS00013269 | TCONS00020082 | 未知蛋白LOC105157673 Unidentified protein LOC105157673 |
TCONS00013844 | TCONS00020913 | 假定蛋白CISIN1g009300 mg Hypothetical protein CISIN_1g009300 mg |
TCONS00019521 | TCONS00029324 | 环H2指蛋白ATL56-like Ring-H2 finger protein ATL56-like |
TCONS00020385 | TCONS00030627 | 50S核糖体蛋白L9,叶绿体50S ribosomal protein L9, chloroplastid |
TCONS00022374 | TCONS00033440 | 未知蛋白LOC105950323 Unidentified protein LOC105950323 |
TCONS00024340 | TCONS00036345 | 即刻早期反应3-相互作用样蛋白1 Immediate early response 3-interacting protein 1-like |
TCONS00026311 | TCONS00039315 | FAR1相关序列样蛋白5 Protein FAR1-related sequence 5-like |
TCONS00026585 | TCONS00039688 | 假定蛋白B456012G074800 Hypothetical protein B456012G074800 |
TCONS00026629 | TCONS00039754 | 假定蛋白质VITISV015039 Hypothetical protein VITISV015039 |
TCONS00026807 | TCONS00040000 | 天冬氨酸激酶2,叶绿体Aspartokinase 2, chloroplastid |
TCONS00026848 | TCONS00040068 | 染色体蛋白2型异构体X1 Structural maintenance of chromosomes protein 2-like isoform X1 |
TCONS00027055 | TCONS00040379 | 锌指BED结构域样蛋白RICESLEEPER 1 Zinc finger BED domain-containing protein RICESLEEPER 1-like |
TCONS00030119 | TCONS00045035 | PITH结构域蛋白At3g04780 PITH domain-containing protein At3g04780 |
TCONS00033974 | TCONS00050471 | 36.4 kDa脯氨酸丰富样蛋白36.4 kDa proline-rich protein-like |
在PT、PTI、PTIL-100文库中随机挑选了lncRNA (TCONS_ 00019908)和候选靶基因(TCONS_ 00021677、PAU002322. 1和PAU012048. 1)进行qRT-PCR验证,检验高通量测序结果的可靠性。结果(图 2)发现:挑选验证的lncRNA和靶基因的表达趋势与高通量测序结果保持一致,证明了RNA-Seq测序数据的准确性。
3 讨论与结论丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一组能被细胞外的不同刺激信号激活并介导信号从细胞膜向细胞核传导的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,调控着许多生理活动,如炎症、凋亡、抗病等[17-18]。本研究发现lncRNA (TCONS_ 00009507)和靶基因PAU008570.1(丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶EDR1)在PT/PTI和PT/PTIL-100中FPKM值均表现显著上调,而在PTI/PTIL-100中表达量没有显著差异,KEGG代谢通路分析显示PAU008570. 1参与MAPK信号通路。这可能表明与健康泡桐苗相比,泡桐丛枝病苗和利福平处理的丛枝病苗生长发育发生了显著变化,并且受到植原体感染后MAPK级联反应被激活,TCONS_ 00009507调控它的靶基因的表达量积极参与MAPK信号通路,而泡桐丛枝病苗和利福平处理的丛枝病苗中的TCONS_ 00009507均高表达,所以在PTI/PTIL-100中差异不显著。
泛素连接酶在植物对病原物防御机制中发挥重要作用,可以参与病原物识别过程、调节抗性相关信号通路,还有些病原物释放的效应因子就是泛素连接酶或者类似物, 可以通过干扰宿主体内的蛋白酶达到致病目的[19-20]。本研究中lncRNA TCONS_ 00019521在健康泡桐苗和利福平处理的泡桐丛植病苗中未表达,在植原体侵染的泡桐丛枝病苗中表达量显著上升,它的靶基因TCONS_ 00029324也是特别在PTI中显著上调,该基因在Nr注释为RING-H2 finger protein ATL56-like,在京都基因与基因S期激酶相关蛋白1 (S-phase kinase associated protein 1,SKP1)是SCF (SKP1/CulL/Fbox)型E3泛素连接酶途径的核心蛋白[21]。侵染植物的病原物被观察到会劫持SCF复合物的成分以促进重要细胞蛋白的降解,从而对抗植物防御体系,例如, 水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)编码的P7-2是一种破坏性的病毒病原体,P7-2蛋白可以利用其C端与水稻的SKP1及其他植物的SKP1相互作用[22]。本研究中TCONS_ 00012917在PT/PTI中表达量显著下调,其靶基因TCONS_ 00019573 (SKP1-like protein 12)表达量也下调,参与KEGG代谢通路的泛素介导的蛋白水解途径。预测这可能是泡桐丛枝植原体感染泡桐后,产物大量与SKP1结合,导致TCONS_ 00019573及靶基因的表达量下降。
植物的形态建成依赖于细胞不断地分裂增殖和不同类型细胞的特化,离不开细胞周期在时间和空间上的正常进行。细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)是细胞周期调控的中心,CDK与相应的细胞周期蛋白(cyclins)结合形成复合物,并通过cyclins的周期性表达和降解,推动细胞周期各时相的有序进行[23]。ZBED1 (zinc finger,BED-type containing 1)属于锌指蛋白ZBED家族,是影响细胞增殖功能重要的转录因子。有研究发现,ZBED1可能通过调控cyclins 3的表达而引起细胞恶性增殖[24]。本研究发现TCONS_ 00030963在PT/PTI、PT/PTIL-100中FPKM值均表现显著下调,正调控其靶基因CDK3 (TCONS_ 00046219)的表达。TCONS_ 0002705和靶基因TCONS_ 00040379 (ZBED1-like)在PT/PTI中表达量都显著上升。推测泡桐丛枝植原体侵染提高了泡桐内ZBED1的表达,降低了CDK3的表达,引起细胞恶性增殖和打断细胞周期的正常进行,从而影响泡桐生长发育和形态变化。
本研究利用高通量测序平台建立泡桐健康苗、泡桐丛枝病苗和利福平处理的泡桐丛枝病苗文库,寻找与泡桐丛枝病相关的lncRNAs和靶基因,预测lncRNAs (TCONS_ 00009507、TCONS_ 00019521和TCONS_ 00012917)分别调控靶基因参与泡桐丛枝植原体与泡桐互作,TCONS_ 00030963和TCONS_ 0002705调控靶基因参与泡桐丛枝植原体影响细胞周期改变泡桐形态建成的过程,为植物与其病原相互作用机制及泡桐丛枝病的分子生物学研究提供理论依据。
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