2019, Vol. 39
文章信息
- 殷雨晴, 任健, 陈典, 王勇
- YIN Yuqing, REN Jian, CHEN Dian, WANG Yong
- 马占相思AmCesA2基因的克隆与表达分析
- Cloning and expression analysis of AmCesA2 gene in Acacia mangium
- 森林与环境学报,2019, 39(2): 174-180.
- Journal of Forest and Environment,2019, 39(2): 174-180.
- http://dx.doi.org/10.13324/j.cnki.jfcf.2019.02.009
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文章历史
- 收稿日期: 2018-04-19
- 修回日期: 2018-05-15
2. 农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室, 黑龙江 哈尔滨 150030
2. Key Laboratory of Biology Improvement of Horticulture Crops Ministry of Agriculture at Northeast Region, Harbin, Heilongjiang 150030, China
马占相思(Acacia mangium Willd)为豆科金合欢属，常绿高大乔木，生长迅速，是热带地区重要的经济树种，具有较大的栽培面积[1-2]。马占相思木质坚硬，适合于造纸、人造板以及家具制造等[3]。除具有商业价值外，还常用于恢复矿区退化土地，经济效益和生态效益都十分显著[4]。作为一种速生类木材，相思树的纤维素含量是其重要的经济性状[5]。
纤维素是由D-葡萄糖以β-1，4糖苷键组成的大分子多糖，分子量在50 000~2 500 000之间，相当于300~15 000个葡萄糖基，是植物细胞壁的主要多糖类组成成分，也是众多生物不可缺少的结构组分[6-9]。它由植物纤维素合酶亚基A组成的纤维素合酶复合体和其他酶共同作用而形成的，储存在植物的初生壁和次生壁中[10-13]。其中，纤维素合酶是植物体内纤维素合成最为关键的酶[14]。纤维素合成酶基因最早从木醋杆菌[15]中分离得到，而植物中的纤维素合酶基因最早从陆地棉[16]纤维中被克隆得到。随后，其他植物中的纤维素合酶基因陆续被发现，如毛果杨[17]、松树[18]、桉树[19]、杨树[20]等。通过对这些木本类植物的纤维素合酶基因研究，发现在植物细胞壁的初生壁和次生壁形成时期，纤维素合酶基因的表达含量相对较高，尤其在次生维管组织发育的后期高表达，表明其主要参与木材次生壁纤维素的合成。近年来，有关纤维素合酶的研究也取得了许多成果。张海平等[21]人将调控木醋杆菌纤维素合成的两个主要基因acsA和acsB构建双价载体，分别转化白色棉和彩色棉，提高了棉花的纤维品质。用转基因方法特异性上调GA20-oxidase和抑制GA2-oxidase，使棉花纤维内源性GA生物活性升高，促进了纤维素的生物合成和次生壁的沉积，进而稳定纤维的形态[22]。
本研究通过RACE技术，从马占相思的幼苗中获得了1个CesA基因AmCesA2，通过分析该基因的序列，预测其编码蛋白结构，进而分析该基因在植株内的表达情况和对激素的反应，并对其功能做出了预测，从而为后续的实验研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 植物材料马占相思的种子购自山东省济南市日出种业有限责任公司，其幼苗的培养基质为排水条件良好的砂质土壤，温室内温度保持在25~35 ℃之间。选取在温室中生长约30~40 d苗龄的马占相思幼苗用于RNA提取，用于检测基因表达的为随机选取的3组各10株40 d苗龄马占相思的根、茎、叶，分别取样，混合后用液氮速冻，于-80 ℃的条件下保存。
1.2 AmCesA2基因的克隆以硫氰酸胍-酚法提取相思树总RNA [23]，以OligodT为引物进行反转录。现有的研究结果表明，生物的纤维素合酶家族具有非常保守的结构域，为此，分别就2段保守结构域设计了2条简并引物AmCesDe1和AmCesDe2 (表 1)，结合3′RACE技术和5′RACE技术进行基因克隆。
| 序号 Number |
引物名称 Primer name |
引物序列(5′→3′) Primer sequence |
应用Application |
| 1 | AmCesDe1 | GGTIAT(A/C/T)TG(T/C)GA(A/G)(A/G)TITGGTT(T/C)GC | 扩增AmCesA2中间cDNA To amplify the intermediate cDNA of AmCesA2 |
| 2 | Aces2.3-3 | TGGTTGGGTCAACATGCTTGCT | |
| 3 | AmCesDe2 | TT(T/C)CCICA(A/G)(A/C)GITT(T/C)GA(T/C)GGIAT(A/C/T)GA | AmCesA2 3′ RACE |
| 4 | OligodT | GCGGTACCCTTTTTTTTTTTTTTTTTT | |
| 5 | AAP | GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG | Nest PCR for AmCesA2 |
| 6 | Aces2GSP1 | ATATATCAACAGCTGCTAGT | AmCesA2 5′ RACE |
| 7 | AUAP | GGCCACGCGTCGACTAGTAC | |
| 8 | Aces2GSP2 | AGATATGTTTCCCGGTTTACC | |
| 9 | Aces2.3′-1 | TGAGCTCTTCTAGCAGTTTATTCCACACT | 扩增AmCesA2全长cDNA Amplify AmCesA2 full-length cDNA |
| 10 | Aces2.5′-1 | ATCTAGACAGCTTATGGAGTCAGAAGG | |
| 11 | QAmCesA2F | AGAGGCTTTCAATGGCATCC | 实时定量基因荧光检测Rreal-time quantitative gene fluorescence detection |
| 12 | QAmCesA2R | CCAGGATCCACAGCCCTAAT | |
| 13 | ActinF | GGTAACATTGTCCTCTGTGGT | 荧光定量检测内参基因Fluorescence quantitative detection of internal reference genes |
| 14 | ActinR | CATCGTATTCTGCCTTCGA |
以反转录产物为模板，用AmCesDe2和OligodT引物进行第一步PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性5 min，热启动; 94 ℃ 25 s, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 33个循环；72 ℃ 10 min终止反应。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，过柱回收，与pGEM-T easy载体连接，转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆测序。根据测序结果设计基因特异引物以Aces2.3-3仍以反转录产物为模板，以Aces2.3-3、AmCesDe1进行第二步PCR扩增，条件：94 ℃预变性5 min，热启动; 94 ℃ 30 s, 53 ℃ 1 min，72 ℃ 90s，30个循环；72 ℃ 10 min终止反应。将所得产物测序后与第一次PCR所得产物组装，设计基因特异引物Aces2GSP1和Aces2GSP2，利用Takara公司5′-Full RACE Kit with TAP试剂盒进行5′RACE。RACE反应按试剂盒说明操作(Code No.6106)。所得的5′RACE片段测序后与所获得的下游序列组装，根据序列信息，设计引物Aces2.3′-1, Aces2.5′-1，进行PCR扩增得基因cDNA序列。
1.3 统计分析方法以DNAMAN6.0软件应用于序列比对；EXPASY-ProtParamtool (http://web.expasy.org/protparam/)用于对蛋白质的一级结构进分析；TMHMM Sever v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜结构预测；PFAM (http://pfam.xfam.org/)用于对蛋白质的结构域进行分析；MEGA 5.22用于系统进化树的构建。
1.4 统计分析方法根据克隆得到的AmCesA2的cDNA，设计荧光定量PCR引物(表 1)，分别提取3组相思树根、茎、叶的总RNA，反转录均衡浓度后，取1μl cDNA作为模板，利用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)荧光定量试剂盒完成荧光定量实验。
1.5 AmCesA2对激素的应答反应激素处理试验体系，条件参照魏凯莉的方法并加以适当调整[24]。方法为：将40 d苗龄且生长旺盛的马占相思幼苗分成3组，每组分别喷施10 μmol · L-1赤霉素(gibberellin, GA3), 0.1 mol · L-16-BA (6-benzylaminopurine), 1 nmol · L-124-表油菜素内酯(24-epicastasterone)。每隔2 h均匀喷施1次共喷施3次，每喷施1次后立刻取其叶片并放置-80 ℃冰箱中保存。每个处理设置1个对照，喷施与激素等量的蒸馏水。每个处理设置3次重复。
2 结果与分析 2.1 相思树AmCesA2基因的克隆以AmCesDe2、OligodT为引物扩增出一条包含有预期为1.6 kb的半弥散条带[图 1(a)]，回收该条带，测序后表明为纤维素同源基因的3′端部分序列，据此设计引物Aces2.3-3，以Aces2.3-3、AmCesDe1为引物进行扩增，得到了一条约1.1 kb的cDNA片段[图 1(b)]，之后通过5′RACE获得一条约1.0 kb的条带[图 1(c)]，3个片段进行组装，最终得到一个长度为3 643 bp的AmCesA2 (AY643520.1)基因[图 1(d)]，其编码区为3 228 bp，推测编码1 075个氨基酸，5′上游区为263 bp，3′下游区为152 bp。
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图 1 AmCesA2基因的扩增 Fig. 1 Amplification of AmCesA2 gene |
采用ExPASY对AmCesA2基因编码的蛋白质一级结构进行分析。分析表明，AmCesA2正电荷氨基酸残基数(Arg+Lys)的数目为119, 负电荷氨基酸残基数(Asp+Glu)的数目也为119，等电点为7.19，为碱性蛋白质。它的不稳定系数是38.56，属于稳定蛋白质。利用TMHMM Sever v.2.0进行跨膜结构预测。结果显示AmCesA2 N端存在2个跨膜区, 在C端具有6个跨膜区。利用Pfam对AmCesA2结构域进行分析，表明它存在着糖基转移酶类家族所特有的D, D, D, QxxRW结构。在整个蛋白的结构上，于N端存在一个Zinc-finger区，其后为植物纤维素合酶家族所特有的高度可变区1 (HVR-1区)，之后顺序为植物特异性保守区(P-CR)和高度可变区2 (HVR-2)，其中P-CR位于保守的domainA区域内，在HVR-2后为另一个纤维素合酶家族的保守区域domainB。
2.3 相思树AmCesA2同源性比对利用DNAman6.0软件将AmCesA2与拟南芥AtCesA3、陆地棉GhCesA3、毛白杨PtCesA3、银合欢LlCesA7进行序列比对分析，同时把相应的区域进行了标注(图 2)。比对结果显示，5个纤维素合酶具有较高的同源性，且在C端的同源性更高，高度可变区分别位于N端和保守的C端中部。进一步比对5个基因氨基酸水平上的相似性，发现AmCesA2与拟南芥AtCesA3的相似性为86.62%，与陆地棉GhCesA3的相似性为89.41%，与毛白杨PtCesA3的相似性为90.57%，与银合欢LlCesA7的相似性为95.81%，说明该基因家族同源性很高，进化上是非常保守的。
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注：3个Asp (D)残基和QxxRW基序标有星号。顶部双点划线表示植物保守区(P-CR)，可变区(VR1和-2)以及RING指状基序。 Note: 3 Asp (D) residues and the QxxRW motif that are marked by asterisks. The plant conserved region (P-CR), variable regions (VR1 and -2), and RING finger motif are also shown by overhead double-dashed lines. 图 2 AmCesA2氨基酸序列比对分析 Fig. 2 Alignment of the deduced amino acid sequences of AmCesA2 |
选取拟南芥、陆地棉、银合欢、杨树、白桦、赤桉、大豆、光皮桦、火炬松、巨桉、绿竹、马铃薯、花生、毛竹、杉木、亚麻、玉米等植物的纤维素合酶基因序列, 利用CLUSTAL1.81和MEGA5.22的NJ算法进行进化树构建，以了解植物CesA的进化特点，并选择拟南芥纤维素合酶类似蛋白(Csl)作为外类群以检验分析结果。结果表明，AmCesA2与LlCesA7、LlCesA8最为接近(图 3)，这符合它们均为豆科含羞草亚科植物的特性。相思树AmCesA2进化树中并没有出现预期同木本植物聚集的情况，推测CesA的分化应早于草本植物和木本植物的分化。在与拟南芥纤维素合酶基因的比较中发现AmCesA2和拟南芥的AtCesA3比较相似，进一步比较其相似性为86.62%，说明它的功能可能与相应的拟南芥纤维素合酶异构体相近，且CesA基因与外类群基因Csl聚为两类，说明结果的可靠性较高。
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图 3 基于CesA的系统进化分析 Fig. 3 Phylogenetic analysis based on CesA |
AmCesA2基因广泛表达于黑木相思根、茎、叶中(图 4)，其中在根和叶中的表达量相似，差异不显著(P＞0.05)，在茎中的表达量最高，约2倍于根中和叶中的表达量，表达丰度之间存在显著差异(P＜0.05)。
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注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05);不同大写字母表示差异极显著(P<0.01), Note: different lowercase letters denote significant difference(P<0.05), different uppercase letters denote highly significant difference(P<0.01). 图 4 各器官中AmcesA2的相对表达量 Fig. 4 AmcesA2 expression in different organs |
研究表明，激素能诱导CesA基因的表达[24-25]。以GA3, 6-BA, BR处理相思幼苗，观察AmCesA2对激素的反应。结果表明，在3种激素都增加了AmCesA2的表达量，且随着处理时间的延长，呈递增趋势(图 5)。AmCesA2对3种激素的响应程度不同，AmCesA2对GA3和6-BA的响应程度更高，且对GA3的响应最为强烈。GA3和6-BA具有促进细胞伸长和分裂的作用，因此推测AmCesA2可能参与细胞壁的快速形成。
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注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05);不同大写字母表示差异极显著(P<0.01), Note: different lowercase letters denote significant difference(P<0.05), different uppercase letters denote highly significant difference(P<0.01). 图 5 AmCesA2对3种激素的反应 Fig. 5 AmCesA2 response to three hormones |
纤维素是植物重要的特征结构，可调控植物的形态建成，研究纤维素合成对可再生生物能源具有重要意义[26-29]。植物CesA基因以超基因家族形式存在，不同成员参与不同组织、器官或细胞壁层次纤维素合成[30]。其中大部分CesA基因参与初生壁的形成，而参与次生壁合成的CesA基因较少[31-32]。研究表明CesA基因编码的蛋白质都有类似的结构：具有8个跨膜结构域，N端有2个，C端有6个，此外在N端还有1个锌指结构域，可能和蛋白质之间的相互作用有关，CesA蛋白的保守功能域为外D, D, D, QxxRW，本研究以相思属的马占相思的幼苗为材料，从中获取了AmCesA2，其编码的蛋白具有CesA的典型特征。
纤维素合酶以亚基组成复合体的形式进行纤维素合成，在离体条件下进行基因的作用机理及功能研究具有较大的难度[33]。因此，可通过基因间的相似性，推测某一未知基因的功能[34]。通过拟南芥纤维素合酶基因(AtCesA)家族进行表达分析发现, 拟南芥纤维素合酶基因AtCesA1, 3, 6参与细胞壁初生壁的合成，AtCesA4, 7, 8细胞壁次生壁的合成，并存在明显的共表达现象[35-36]。其中, AtCesA1, 3, 6在全生育期表达, AtCesA4, 7, 8主要在根、茎和叶脉等次生壁细胞中表达。AtCesA2和AtCesA5、AtCesA6和AtCesA1以及AtCesA9和AtCesA10等基因对均有基因重复作用。从进化树分析可知，AmCesA2和拟南芥的AtCesA3在结构上比较相似，根据织特异性表达结果显示，虽然AmCesA2在相思树的3个组织器官中均能检测到表达，但其组织器官特异性差异较显著，在茎中AmCesA2的表达量最高，而快速成长的幼苗的茎中最主要的成份是发育中的木质部，这意味着AmCesA2可能既参与初级细胞壁也参与次级细胞壁的形成。通过AmCesA2对激素的反应分析，发现在不同的激素处理下存在差异，GA3处理最为显著地提高AmCesA2的表达量，6-BA次之，GA3和6-BA均具有促进细胞伸长发育的作用，因此AmCesA2有可能加快细胞壁的形成。
最近有研究表明多种植物激素和转录因子参与纤维素合酶的调控。在水稻中GA信号途径通过多级转录因子调控次生壁纤维素合酶基因表达[7]，在拟南芥中生长素是花药发育过程中次生壁合成的负调控因子[37]。在转录水平上, NAC转录因子可以激活一些与次生壁合成相关的纤维素合酶基因[38]，拟南芥转录因子MYB46可直接调节三种次生壁纤维素合酶AtCesA4，AtCesA7和AtCesA8 [39]。水稻转录因子OsMYB58/63直接上调水稻次生壁特异性纤维素合酶基因OsCesA7的表达[7]。但纤维素合酶是否参与其他途径，还需进一步研究，未来课题组拟通过构建AmCesA2的正义表达载体并转化模式植物，研究该基因的信号转导途径并进行功能验证，为研究相思树纤维素合酶的功能提供更丰富的理论依据，并为育成高纤维率的马占相思良种提供帮助。
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