杉木[Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook.)]是我国重要的速生用材树种，广泛分布于南方亚热带地区。由于集约化经营强度高、营林措施不合理、种植方式单一，以及杉木自身生物学特性等原因，杉木人工林连栽引起地力衰退和林地生产力降低^[1-5]。在森林生态系统中，氮素是植物生长的必需元素，通常也是森林生态系统初级生产力的主要限制性营养因素^[6]。土壤氮素对于微生物的转化作用最为敏感，其含量和存在形态影响森林生态系统养分循环过程和林地生产力，是森林生态系统物质循环的关键因子之一^[7-8]。因此，探讨不同连栽代数杉木人工林土壤氮素转化及其影响机理对于维持森林生态系统的生产力具有重要意义。

土壤中的氮素往往以复杂形态存在，主要包括土壤全氮(total nitrogen，TN)、铵态氮(NH₄⁺-N)、硝态氮(NO₃^--N)、可溶性有机氮(dissolved organic nitrogen，DON)以及微生物量氮(microbial biomass nitrogen，MBN)等。一方面，氮是植物从土壤中需求量最大的元素，另一方面，它又是最易通过淋溶和挥发从系统中损失的元素^[7]。目前，有关杉木不同连栽代数土壤氮形态和含量的研究很多。例如，何友军等^[8]研究发现，随着连栽代数增加，土壤微生物量氮含量略有下降，但土壤全氮和铵态氮含量没有显著变化。刘丽等^[9]研究发现，随着连栽代数增加，土壤全氮含量逐渐降低，而铵态氮含量表现为1代杉木人工林 < 2代杉木人工林 < 常绿阔叶林，土壤硝态氮含量随连栽代数增加无显著变化。因此，土壤中不同形态氮素含量随着连栽代数的变化还没有一致的结论，且有关杉木连栽对土壤氮素转化过程的影响机理尚不清楚。

土壤酶是植物根系和土壤微生物的活动产物，对土壤养分的转换和循环起调节作用^[11-12]，土壤酶活性能够表征土壤养分转化过程和强弱 。土壤脲酶(urease)、蛋白酶(protease)、硝酸还原酶(nitrate reductase, Nar)、亚硝酸还原酶(nitrite reductase, NiR)、天冬酰胺酶(asparaginase)和N-乙酰胺基葡萄糖核苷酶(N-acetamido glucosidase，NAG)是参与土壤氮素循环的重要催化酶^[13-17]，但是这些酶在不同连栽代数土壤中的活性变化研究比较缺乏，对于它们如何影响土壤氮转化的机理认识尚不够清楚。

为此，本研究以我国湖南会同中亚热带地带性天然次生林(natural second forest，NSF)、1代杉木人工林(first rotation plantation of Chinese fir，FRP)和2代杉木人工林(second rotation plantation of Chinese fir，FRP)为研究对象，开展了杉木连栽对土壤不同形态氮含量及氮转化过程相关的6种关键土壤酶(土壤脲酶、蛋白酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、天冬酰胺酶和N-乙酰胺基葡萄糖核苷酶)活性影响研究，以期为评价杉木连栽经营方式对土壤氮素转化及其对林地生产力的影响机理提供理论依据。

研究样地位于湖南会同森林生态系统国家野外科学观测研究站(110°08′E，27°09′N)，海拔200~500 m，为低山丘陵地貌类型。气候属亚热带湿润气候，年均温度16.5 ℃，年均降水量约1 200 mm，年均相对湿度80%。土壤为板页岩发育而成的红黄壤^[9]，地带性植被为典型的亚热带常绿阔叶林。优势树种为栲树(Castanopsis fargesii Franch.)、枫香(Liquidambar formosana Hance)和刨花润楠(Machilus pauhoi Kanehira)等。

2017年8月，选择地带性天然次生林、1代和2代杉木人工林作为研究样地(表 1)。杉木1代和2代人工林均为全垦整地，造林密度均为2 500株· hm^-2 (1年生实生苗)，造林后前3 a每年抚育锄草两次(每年5月和9月)，造林后前两年每年于生长季前一月(约3月份)施肥1次(N肥)。由于施肥及抚育除草时间是在林木生长初期，对于成熟林的影响可以忽略不计。天然林面积约20 hm²，优势种主要有红栲(Castanopsis hystrix Hook.f.& Thomson ex A.DC.)、枫香、刨花润楠、青冈[Quercus glauca (Thunb.) Oerst.]等。

在3种林分内分别设置4个20 m×20 m样方，共12个样方。随后，在每个样方内用土钻随机采集0~10 cm土壤，将8~10个土钻样品充分混合为1个土样，共12个土样。将每个土样分为2份，其中1份新鲜土样过2 mm筛后放置于冰箱中(4 ℃)保存，用于测定土壤微生物生物量氮(MBN)、铵态氮(NH₄⁺-N)、硝态氮(NO₃^--N)及土壤氮转化酶活性，另1份土壤风干后，用于测定土壤pH值和全氮(TN)等。

土壤pH值采用雷磁PHS-3C型pH计进行测定(土水比1 : 5)。土壤全碳(TC)和全氮(TN)采用元素分析仪(vario ISOTOPE cube, Elementar, German)测定。土壤铵态氮(NH₄⁺-N)、硝态氮(NO₃^--N)用2 mol · L^-1的KCl溶液浸提土壤后，采用全自动间断分析仪(SmartChem 200，AMS/Alliance，Italy)测定。土壤微生物量碳氮采用氯仿熏蒸浸提法，即用0.5 mol · L^-1的K₂SO₄溶液浸提(土水比例为1 : 4)、过滤，采用总有机碳分析仪(TOC-L CPH，Shimadzu，Japan)测定浸提液中的碳和氮含量，根据熏蒸和未熏蒸样品的可溶性碳氮差值计算出土壤微生物量碳和氮的含量^[18]。测定土壤酶活性的鲜土用PBS缓冲液浸提(土水比1 : 10)后，采用北京华博德亿公司elisa酶联免疫分析试剂盒提取，利用多功能酶标仪(BioTek Synergy2 Gene 5，American)在波长450 nm下测定其OD值，换算得出其浓度，酶活性结果以单位体积(L^-1)单位时间(min^-1)内生成的酶的摩尔质量(μmol)来表征。该试剂盒原理是应用双抗体夹心法测定土壤样本中的酶活性水平，以亚硝酸还原酶为例，用纯化的亚硝酸还原酶抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入亚硝酸还原酶，再与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的亚硝酸还原酶抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，彻底洗涤后加底物四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的亚硝酸还原酶呈正相关。其他酶均以类似方法测定。

基于Excel 2010进行数据处理，利用SPSS 19.0进行统计分析。采用单因素方差分析检验差异显著性，P= 0.05；用双因素方差分析指示树种和处理及其交互作用对土壤氮组分影响的差异。通过Pearson相关系数分析确定土壤不同氮组分与酶活性的相关性。

3种林分的土壤均为酸性，pH值变化范围是4.13~4.73(表 2)，其中天然次生林pH值显著高于1代和2代杉木人工林(P < 0.05)，但1代杉木人工林和2代杉木人工林差异不显著。土壤硝态氮含量变化在0.63~6.45 mg·kg^-1之间，2代杉木人工林显著高于天然次生林(P < 0.05)，但1代杉木林和2代杉木林土壤硝态氮含量无显著差异。3种林分土壤全氮含量、碳氮比、土壤铵态氮、土壤可溶性有机氮和微生物量氮含量差异均不显著(P>0.05)。

尾巨桉人工林中，去除凋落物显著降低了β-葡萄糖苷酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶和过氧化物酶活性(P＜0.05) (图 2)。湿地松人工林中，去除凋落物和根系后均显著增加了多酚氧化酶活性(P＜0.01)，而对其他酶活性影响不显著。木麻黄人工林中，去除凋落物和根系均显著降低了β-葡萄糖苷酶和乙酰氨基葡萄糖苷酶活性(P < 0.05)。在纹荚相思人工林中，去除凋落物和根系后4种土壤酶活性均无显著变化。

	注：不同小写字母表示同一树种差异显著(P < 0.05)。 Note: different lowercase letters denote significant difference in the same tree species (P < 0.05). 图 2 4个树种人工林去除凋落物和根系后土壤酶活性 Fig. 2 oil enzyme activity change in litter and root exclusion treatments in the 4 forest plantations
图选项

土壤亚硝酸还原酶活性与pH值呈显著负相关，与微生物量氮呈极显著正相关(表 3)。蛋白酶活性与土壤硝态氮含量呈显著正相关(表 3)。天冬酰胺酶活性与土壤pH值呈显著正相关，与其他形态氮含量无显著相关(表 3)。硝酸还原酶活性与全氮含量呈极显著正相关(表 3)。

本研究结果表明，随着连栽代数增加，土壤pH值逐渐降低，天然次生林转变为杉木人工林能够导致土壤酸化，且随着连栽代数增加，土壤酸化进一步加剧。该研究结果与杨玉盛等^[3]研究一致，这可能是由于杉木根系分泌酸性有机物较多及微生物分泌物增加进而导致土壤酸化加剧^[19-20]。

我国南方亚热带地区天然次生林转变为杉木人工林以及随着杉木人工林连栽能够影响土壤不同形态氮含量^[8-9]。本研究发现，土壤全氮、铵态氮、可溶性有机氮和微生物量氮含量在3种林地差异不显著，这与何友军^[8]等的研究结果一致。然而，本研究中土壤硝态氮含量呈现出随着连栽代数增加递增的趋势(表 2)。土壤铵态氮转变为硝态氮的氨氧化作用主要是由土壤中氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)和氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)参与完成。有研究表明，氨氧化古菌(AOA)对于酸性土壤中的氨有更高的亲和力，更适宜生存在pH值较低的酸性土壤^{[8, 21-22]}。因此，随着天然次生林转变为杉木人工林，土壤酸性加剧，有可能导致土壤中氨氧化古菌(AOA)增加，进而导致土壤硝态氮含量呈增加趋势，本研究选择的试验样地林分均为成熟林，对于养分含量需求量大，消耗多，但营养归还也多^[23]，特别是N素归还较多，周丽丽^[24]研究发现，杉木凋落物养分归还量具有明显的月动态特征，N归还量成熟林表现为双峰型(5月与8月)，本研究采样季节正是8月，这也可能是土壤中硝态氮含量增加的原因之一^[19]。也有研究表明，杉木人工林生态系统中营养元素绝大多数贮存在土壤中^[25]，而土壤硝态氮带负电，相比于铵态氮更易于从林地中流失，本研究样地位于多雨潮湿的中亚热带气候区，降水充沛，连栽后土壤中硝态氮含量的增高加剧了其淋溶损失的风险，不利于土壤氮素的截留和保护。

据报道，土壤铵态氮和硝态氮含量具有明显的季节性变化和空间变异性，表现为春季最高和夏季最低^[26]。由于本研究只涉及一次采样，发生在8月份，因此与其他报道中的铵态氮和硝态氮含量也有所不同。刘丽等^[9]报道了连栽1代和2代杉木人工林土壤硝态氮含量与天然林相比并无显著差异，连栽1代土壤铵态氮含量显著低于天然林和2代林，但其采样季节在4月，测得土壤铵态氮和硝态氮含量均高于本研究中测定值。此外，胡亚利^[23]研究表明：密度对于杉木人工林土壤养分变化也有影响，密度会影响土壤中的速效磷、全K、全P、碱解氮、有机质含量、pH值，但是密度变化对于全N影响不明显。也有研究表明：林木种植密度过高会影响土壤养分含量，导致地力衰退^[26]，本研究中选择的林地1代杉木人工林和2代杉木人工林种植密度均超过了最高密度等级(1 500株· hm^-2)。由此我们推论，土壤铵态氮和硝态氮水平的变化是水分、温度、密度等多方面环境因子作用影响微生物矿化、硝化和反硝化过程的综合结果，今后研究应继续关注杉木连栽林地土壤不同形态氮含量的季节性变化特征。

土壤酶是促进土壤养分循环过程中各种生物化学反应的催化剂，土壤酶活性高低可以反映土壤生物化学过程的强度和方向，还能表征土壤养分元素的动态变化^[13-17]。本研究结果表明，土壤蛋白酶活性随着连栽代数增加而明显增加，表现为2代林> 1代林>天然次生林，土壤蛋白酶主要水解有机氮为氨基酸，它的主要来源是植物、动物、微生物等残体^[28]，土壤蛋白酶活性随着连栽代数的增加而增加，这有可能是土壤微生物数量增加的原因，本研究采样时间为2017年8月，是微生物活动最强烈的时期，有研究证明，随着杉木连栽代数增加，土壤中的真菌数量不断增加^[9]；此外，杉木成熟林凋落物增加也可能会影响土壤蛋白酶活性的强弱。相关分析表明土壤含水量和硝态氮含量与蛋白酶活性紧密相关，因此土壤硝态氮含量随连栽增高可能是提高蛋白酶活性的原因。土壤脲酶是一种专性较强的酶，它促进尿素水解生成氨，是林木氮素营养的直接来源^[28]。前人报道中连栽会降低土壤脲酶活性^[28-29]，与本研究结果不一致，这可能与杉木所处发育阶段不同有关。孙启武等^[29]的研究中报道了杉木幼龄林和中龄林的土壤脲酶活性第2代较第1代降低，而本研究中杉木林的林龄为27~34年的成熟林，林木生长已经过了速生期，养分需求量降低，氮素周转比较缓慢，连栽的影响不如幼龄期和中龄期明显。也有前人报道杉木林进入近熟林阶段后，土壤状况明显恢复，在成熟林-过熟林阶段多数土壤物理、化学和微生物指标都达到甚至超过幼龄林阶段水平^[30]。

土壤硝酸酶在嫌气和好气条件下都可存在，其在前一条件下参与土壤反硝化过程，催化反硝化过程的第一步即硝酸盐还原为亚硝酸盐；而在后一条件下仍催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，但不一定与反硝化作用有直接关系^{[12, 31]}。通常认为在嫌气条件下土壤硝酸还原酶活性更强，硝酸还原酶的最适pH值为7 ^[32]，本研究土壤pH值远低于7 (4.13~4.73，表 2)且测定时没有提供严格厌氧条件，故所测硝酸还原酶应处于抑制状态，酶活性处于较低水平(3.38 μmol · min^-1 · L^-1，图 1 )，且3种林分酶活性无显著差异。相关分析表明土壤全氮含量显著影响硝酸还原酶的活性，而硝态氮含量却与硝酸还原酶活性无关(表 3)，这与前人研究结果一致^[33]，其原因值得深入探讨，可能影响机理是间接的。土壤亚硝态氮(NO₂^--N)是氮转化过程的中间产物，存在时间极短，因此对亚硝酸还原酶的研究也比较少^[33]。在好气条件下，亚硝酸还原酶催化土壤中NO₂^--转化为NH₂OH，但在嫌气条件下，催化反硝化过程的NO₂^-→N₂O步骤^{[12, 31]}。

天然次生林的天冬酰胺酶活性显著高于1代，但1代与2代之间、2代与天然次生林之间无明显差异，这可能与土壤pH和温度有关。有研究证明，在高pH值(8.0~10.0)及高温度的土壤中天冬酰胺酶活性更高^[34]。本研究中，天冬酰胺酶活性和土壤pH值也呈显著正相关(表 3)，天然次生林的pH值显著大于1代及2代杉木人工林(表 2)，这可能是造成土壤天冬酰胺酶活性差异的原因。N-乙酰胺基葡萄糖核苷酶(NAG)是一种几丁质酶，参与几丁质转化氨基糖的过程，氨基糖占土壤有机氮的5%~10%，是土壤可矿化氮的主要来源，因此土壤NAG酶活性的高低控制着氮循环的速率^{[17, 35]}。与前人研究中发现NAG酶活与土壤有机碳、全碳、微生物量碳氮呈显著性相关的结果不同^[36]，本研究中NAG酶活与土壤pH值和不同形态氮含量均无显著相关(表 3)，这可能是由于两者属于不同的森林生态系统，具有不同的氮循环特征造成的。张星等^[36]的研究结果来自于由森林向草原过渡的山地森林，而本研究则是在中亚热带森林中进行的，且两者取样土壤分别为根际土和非根际土，其在土壤生态条件、植被恢复阶段和土壤微生物状况等方面均有不同。

本文通过对天然次生林、杉木1代和2代人工林3种林分的土壤氮素特征和土壤酶活性的研究分析，讨论了土壤不同酶活性与土壤不同氮素形态之间的相关性，结果表明，土壤pH值、硝态氮含量、微生物量氮、可溶性有机氮含量以及全氮等指标与土壤酶活性表现出了不同的相关关系。除土壤蛋白酶外，土壤脲酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、天冬酰胺酶和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性随杉木连栽并未显示出明显的变化规律。土壤酶作为一类具有专性催化作用的蛋白质，几乎参与了土壤中氮循环相关的所有生物化学过程。但是由于实验室测定条件和野外原位条件的差异性以及土壤酶对环境变化响应的复杂性，仅通过一次测定，想要准确建立土壤酶活性与氮素养分有效性的关系还存在一定难度 。鉴于土壤酶在氮素转化过程中与土壤微生物的相关关系及相互影响机制还不明确，今后需对杉木连栽过程中土壤氮转化微生物与土壤氮转化酶对N素转化的影响机理进行深入研究。