柑橘溃疡病是世界范围内危害柑橘产业的重要细菌病害, 被列为国内外检疫对象。柑橘溃疡病典型的症状是形成木栓化突起^[1]。叶片上的病斑一般从背面开始发生, 先形成油渍状黄色斑点，随后扩大成圆形，叶的两面隆起, 木栓化, 表面粗糙, 呈火山口状(图 1)。枝梢和果实上的病症木栓化程度更严重，病斑隆起和火山口开裂也更明显^[2], 但一般无黄色晕环。苗木发病后会导致生长不良，成年结果树发病, 引起大量落叶、落果, 减产严重^[3]。

	图 1 柑橘溃疡病在枝条、叶片和果实上的症状[2] Fig. 1 Citrus canker disease on branch, leaf and fruit
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柑橘对溃疡病菌系具有品种特异性。柑橘溃疡病的病原物在世界范围内已经发现有A、B、C、A^*和A^W总共5个菌系，所产生的溃疡症状没有明显差异，需借助血清学、噬菌体敏感性、分子标记及寄主范围等多种生物学特征进行分类^[4-8]。柑橘溃疡病原细菌最先根据来源地和寄主范围被分为A、B和C三种类型菌系。A类型亦称亚洲种，属柑橘黄单胞柑橘亚种(Xanthomonas citri spp. citri)，是致病力最强、蔓延最为广泛的菌系，在绝大多数柑橘品种上发病。B类型为美洲种(X. fuscans pv. aurantifolii)，主要在南美洲的柠檬和墨西哥莱檬上造成危害。C菌系是从巴西圣保罗州的染病墨西哥莱檬中分离得到，还可以侵染酸橙。从中东和印度发现的A^*菌系和美国佛罗里达州发现的A^W菌系都只侵染墨西哥莱檬^{[1, 9]}。

柑橘溃疡病菌利用多种侵染机制在柑橘寄主上引起病害，在与寄主植物接触阶段，病原菌的多糖^[10]、脂多糖^[11]、鞭毛运动^[12]、Ⅱ型分泌系统^[13]对侵染能力都有一定的作用，Ⅲ型分泌系统泌出的效应蛋白是诱导植物产生抗感病性的分子基础^[14]，效应蛋白pthA4转录激活寄主植物中感病基因，引起溃疡的产生^[15]。与溃疡病菌互作时，柑橘植物利用各种策略克服病原菌的入侵，部分重要基因和信号物质又可以被病原菌诱导，响应病原物的入侵，参与溃疡症状的形成。本文主要综述在溃疡病菌侵染时，柑橘基础抗性和基因表达导致的抗感病性差异，感病基因、植物激素和代谢产物在溃疡症状形成过程中的功能。

不同柑橘种类或品种对溃疡病的抗性水平变化较大^[16]。在所有栽培品种和砧木上，甜橙和脐橙品种普遍容易感病，属高度感病品种；宽皮橘的抗病性最强，而柚类感病轻重不一，以台湾白柚抗病性最强，而沙田柚抗病性较弱^[3]。在湿度比较大的热带和亚热带地区，甜橙类‘Hamlin’‘Pineapple’‘Navel’等品种，墨西哥酸橙、柠檬和枸橘被用作嫁接砧木，受柑橘溃疡病菌威胁很大^[17]。在抗性遗传上，用抗病柑橘品种作母本的杂交后代，多数表现为抗病或介于双亲之间；用感病品种作母本的杂交后代几乎都表现为感病^[18-19]。柑橘溃疡病菌通过柑橘表面的气孔、皮孔和伤口入侵，在伤口干燥失水时溢出，随雨水扩散到周围健康的新苗和成株苗木^{[1, 18]}。因此，在叶片表面的附着和定殖是细菌成功侵染为害的前提。抗性相对较强柑橘品种的组织特异性可以阻止溃疡病菌的入侵。表层结构的基础抗性，如叶片组织中气孔结构和油胞数量是柑橘抗性的一个指标^[20]。温寿星^[21]等以‘稻叶温州蜜柑’、‘春见’、‘卡拉卡拉红肉脐橙’、‘玫瑰橙’和‘HB柚’5个柑橘品种的夏梢老熟叶片为材料，发现不同品种叶片的气孔密度与品种抗病性成正相关，叶片显微结构与品种抗病性相关性不显著；李敏等^[22]对另外4个柑橘品种‘星路比葡萄柚’、‘纽荷尔脐橙’、‘新生系3号椪柑’及‘罗浮金柑’的研究，得出类似的结论：不同品种的气孔密度、气孔大小、叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度和下皮层厚度存在差异，但是只有气孔密度与抗性之间能呈现出有规律的对应关系。因此，气孔密度可作为柑橘植株抗柑橘溃疡病早期选择的辅助形态指标^[23]。柑橘表层结构对抗性的重要性还体现在：如果通过创伤接种，田间的54个栽培品种都体现不出来抗性差异^[24]，充分说明在自然条件下柑橘品种的组织特异性对溃疡病菌的阻碍作用。

对柑橘植物感病基因的了解，是在研究溃疡病菌转录激活因子(transcription activator-like effector，TALE)的基础上展开的。植物病原黄单胞菌的转录激活因子依赖34/35氨基酸重复单元与植物靶基因启动子区域的结合, 激活靶基因的转录表达^[25]。最早测序的柑橘溃疡病菌306菌株含有4个转录激活因子，分别由pthA1~4四个基因编码，其中pthA1和pthA2位于质粒pXAC33上，而pthA3和pthA4则位于大质粒pXAC64上^[26]。其中有17.5重复单元的pthA4基因是溃疡病菌致病所必须的，其突变体不能在柑橘上引起溃疡症状^{[15, 27]}。pthA4基因在3种A型菌系(A, A^*, A^W)以及南美菌系B和C中都有一个拷贝^[28]，中国柑橘溃疡病菌的pthA基因含有4~6个不等，Southern杂交图谱出现14个带型^[29]。在强致病力菌株中都含有pthA4基因，一些天然缺失pthA4的菌株在柑橘寄主上的致病力很弱，回补pthA4后可使得菌株的致病力增强^[28]。利用农杆菌介导的瞬时转化，pthA基因在柑橘上也能诱导产生弱的溃疡症状^[30]。在大肠杆菌中异源表达T3SS和pthA同源基因aplI，也可以在柑橘上产生类似溃疡的症状，而且有寄主专化性，在烟草(Nicotiana tabacum Linn.)、大豆[Glycine max (Linn.) Merr.]和棉花(Gossypium arboreum Linn.)上就不会有溃疡产生^[31]。在寄主植物-病原物互作中，pthA4是目前唯一报道的能够诱导寄主植物产生病害症状的基因；在其它的互作模式中，只有病原菌才能引起相应的病害症状。

依据TALE与寄主靶基因识别的分子密码，LI et al^[32]和HU et al^[33]克隆了PthA4蛋白在柑橘植物中的对应感病基因CsLOB1。CsLOB1的表达可以被pthA4激活，但其转录表达不完全依赖pthA4，因为pthA4的突变体也能激活CsLOB1的表达，虽然只有野生型菌株的一半水平，而且pthA1和pthA3同样可以激活CsLOB1的表达^[34]。采用CRISPR/Cas9在‘邓肯’葡萄柚和Citrus sinensis Osbeck中将CsLOB1及启动子序列进行基因编辑后，得到对溃疡高度抗性的转基因植株^[35-36]。从现有的证据来看，pthA4在柑橘寄主中应该有多个靶基因，涉及不同的生物学过程。因为CsLOB1也可以被pthA1和pthA3激活表达，但pthA1和pthA3的突变体对溃疡病菌的致病力却没有影响，pthA4对应的真正感病基因还有待进一步研究。除了转录激活因子的作用，PthA4通过蛋白-蛋白相互作用的方式决定了在寄主植物上的致病性，PthA4与柑橘MAF1特异性互作，释放了后者对RNA聚合酶Ⅲ的抑制作用，增加tRNA的转录和细胞增殖^[37]。

	图 2 柑橘感病基因的激活表达 Fig. 2 Induction of citrus susceptible gene
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在病原菌的诱导下，柑橘植物的多种激素参与溃疡症状的形成，调控细胞的变形和膨大。形成水渍症状是接种柑橘溃疡病菌后最先出现的可观察症状，一般4 d后即可观察到。伴随着接种部位的细胞膨大和细胞分裂，细胞间隙逐渐丧失，使得细胞壁紧密靠拢，通过毛细作用从木质部获得大量水分^[38]。因为细菌在压缩的细胞间隙中复制，并产生大量的胞外多糖，吸收水分以后产生膨胀，接种8 d后，表皮细胞破裂使得细菌溢出到植物表面，通过雨水或人工田间操作，扩散到健康植株，完成侵染循环^[39]。柑橘溃疡病菌可以诱导细胞壁加厚及过氧化氢合成相关的基因的表达。同时被诱导表达的基因还参与细胞壁变形、细胞分裂和膨大、囊泡运输、生长素和赤霉素合成^[40]。外源施用生长素和赤霉素，能促进溃疡症状形成，柑橘植物的纤维素酶、果胶酯酶、半乳糖基转移酶和细胞壁伸展蛋白(expansin)被快速诱导，这与柑橘寄主内的赤霉素合成和生长素信号传导途径密切相关。赤霉素合成抑制和生长素运输抑制剂都可以有效抑制溃疡症状的形成^[41]。外源施用0.25 mmol的水杨酸可以显著抑制溃疡菌在甜橙叶片内的生长，过氧化氢累积量增加，气孔开口变小，抗性相关基因β-1, 3-葡聚糖酶、几丁质酶和病程相关蛋白PR4A的基因表达量上升，增强植物对溃疡病菌的抗性^[42]。

过氧化物酶能将酚类物质转化成木质素和植保素，从而提高植物抗病性^[20]。胡洪涛等^[43]的研究发现，抗病柑橘品种叶片中的过氧化物酶活性高于感病品种, 接种柑橘溃疡病菌以后，抗病品种酶活性增加的幅度明显高于感病类型品种。在聚丙烯酰胺凝胶电泳实验中，抗病性最强的‘椪柑’比‘温州蜜柑’和脐橙品种多出Rf值为0.60、0.64两条过氧化物酶同工酶条带。以几个不同抗性水平的柑橘品种为材料，未接种溃疡病菌之前，植保素的含量几乎没有差异，但是接种以后，抗性品种的植保素含量显著上升，并且均高于感病品种^[44]。在感病甜橙中过表达沈香醇合成酶基因CuSTS3-1，极大地提高了对溃疡病菌的抗性。喷雾接种溃疡病菌，转基因植株诱导防卫反应基因上调表达，原菌在叶片表面的存活率降低^[45]。在栽培品种中，抗性的椪柑品种中，沈香醇含量均高于6个感病品种。外源施用沈香醇化合物，对溃疡病的抑制效果与转基因植株一致，沈香醇的功能不仅仅局限于抑菌化合物，而且可以作为小分子化合物诱导植物抗性^[45]。

虽然尚无对溃疡病的免疫品种，但是不同的品种的抗性水平还是存在差异。华中农业大学利用抗病金橘和感病的甜橙做比较，运用转录学分析这两个柑橘品种对溃疡病菌的差异表达基因，分别发现了794和1 324个差异表达基因，其中230个基因在两个品种中都表达，另外的564和1 094个基因分属品种特异性表达。这些基因涉及细胞壁和多糖代谢，几丁质酶、葡聚糖酶和奇异果甜蛋白等与基础抗性相关的基因。同时，感病甜橙的光合作用基因的表达显著下调^[46]。为了发掘pthA4对应的感病基因，以甜橙‘Valencia’为对象，在接种野生型菌株和pthA4突变体后的6、48、120 h，运用转录组学技术分离到大量与pthA4密切相关的细胞壁降解修饰基因、DNA组装蛋白、糖代谢和细胞分裂基因；而光合运输、细胞色素P450和植物防卫基因下调^[47]。PEREIRA et al^[34]根据TALE-DNA结合识别密码，基于病菌侵染的甜橙叶片，pthA2、pthA4和pthC1的转基因胚轴的转录组学数据，从寄主植物中鉴定出溃疡病菌TALE蛋白对应的多个靶基因。其中，Orange1.1g024897m.g，dioxygenase (Orange1.1g017949m.g)，cysteine proteinase(Orange1.1g018649m.g)和NBS-LRR protein (Orange1.1g07138m.g)是pthA4特异接合识别的基因，参与细胞生长和防卫反应过程。pthA2、pthA4和pthC1在功能上有重叠，在柑橘中有共同的靶基因，诱导生长素和赤霉素合成、细胞分裂和防卫反应。

柑橘-溃疡病菌之间的互作是研究植物病原细菌致病机理的一个模式系统。TALE-DNA之间识别密码的破译，使得溃疡病菌pthA4在柑橘植物中对应的感病基因已经成为研究热点。虽然HU et al^[33]报道了CsLOB1是pthA4的靶基因，但CsLOB1本身是LOB(lateral organ boundaries)基因家族的一个转录调控因子^[48]，所调控的下游基因还不清楚。进入寄主植物细胞后，溃疡病菌的PthA4的功能不局限于转录激活因子的作用，不仅可以结合到靶基因启动子区域，激活靶基因的转录表达，而且还从蛋白-蛋白互作的机制，影响溃疡病害发生^{[37, 49]}。随着实验证据的增多，陆续从柑橘植物中发现了新的靶基因，表明PthA4的靶基因不是唯一的。进一步发掘这些靶基因，有助于理解为什么单个的pthA4基因可以诱导类似溃疡症状的形成。

柑橘感病基因的发掘为抗病育种提供了新的思路。芽变、实生、杂交和诱变育种为柑橘品种的改良和创制做出了很大的贡献，但很多高产优质的柑橘品种在抗病性状上没有优势。利用现代基因编辑技术对柑橘的感病基因进行修饰，既能保持柑橘的优良品质，又可以快速提高品种的抗病性。在技术上对柑橘感病基因进行修饰已经没有障碍，国内外已经报道利用CRISPR/Cas9系统将CsLOB1基因及其启动子序列进行编辑，提高了对溃疡病的抗性^[35-36]。