森林与环境学报  2018, Vol. 38 Issue (1): 104-110   PDF    
http://dx.doi.org/10.13324/j.cnki.jfcf.2018.01.017
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张清华, 连鑫坤, 刘雨菁, 宋笑笑, 陈全助, 宋漳
ZHANG Qinghua, LIAN Xinkun, LIU Yujing, SONG Xiaoxiao, CHEN Quanzhu, SONG Zhang
桉树叶片内生真菌多样性及抗桉树焦枯病菌筛选
Diversity of endophytic fungi of Eucalyptus spp. and their antifungal activity against Calonectria pseudoreteaudii
森林与环境学报,2018, 38(1): 104-110.
Journal of Forest and Environment,2018, 38(1): 104-110.
http://dx.doi.org/10.13324/j.cnki.jfcf.2018.01.017

文章历史

收稿日期: 2017-06-21
修回日期: 2017-09-18
桉树叶片内生真菌多样性及抗桉树焦枯病菌筛选
张清华1, 连鑫坤1,2, 刘雨菁1, 宋笑笑1,3, 陈全助1, 宋漳1     
1. 福建农林大学林学院, 福建 福州 350002;
2. 长泰县林业局, 福建 漳州 363900;
3. 荣成市林业局, 山东 威海 264300
摘要:采用组织分离法从福建省5个地区的桉树叶片中获得87株内生真菌,鉴定为7目及2个未定目,含15属及1个未定属,20种和1个未定种;其中Pseudoplagiostoma eucalypti菌株数量占总数的0.32,为优势种类。龙岩采样点桉树叶片内生真菌辛普森多样性指数为0.92,福州采样点的桉树内生菌香农-威纳指数为2.13,分别高于其它4个地点。经筛选,发现87株内生真菌中,哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ND-13的菌丝能够覆盖桉树焦枯病菌(Calonectria pseudoreteaudii)菌落并抑制其生长;显微观察显示,ND-13菌丝缠绕病原菌菌丝;检测发现ND-13不产生几丁质酶,但产生β-葡聚糖酶。研究结果显示桉树叶片内生真菌种类丰富;ND-13具有防治桉树焦枯病的潜力,表明从桉树内生真菌中筛选抗桉树焦枯病菌是可行的。
关键词内生真菌    多样性    木霉    桉树焦枯病    生物防治    
Diversity of endophytic fungi of Eucalyptus spp. and their antifungal activity against Calonectria pseudoreteaudii
ZHANG Qinghua1, LIAN Xinkun1,2, LIU Yujing1, SONG Xiaoxiao1,3, CHEN Quanzhu1, SONG Zhang1     
1. College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China;
2. Forestry Bureau of Changtai, Zhangzhou, Fujian 363900, China;
3. Forestry Bureau of Rongcheng, Weihai, Shandong 264300, China
Abstract: By tissue separation method, 87 endophytic fungal strains were isolated from Eucalyptus leaves which were collected from 5 sites in Fujian Province. All the endophytic strains were identified into 7 orders and 2 unidentified orders, 15 genera and 1 unidentified genus, 20 species and 1 unidentified species. Pseudoplagiostoma eucalypti strains were the dominant species accounting for 0.32 of the total. The Simpson diversity index of Eucalyptus endophytic fungi was 0.92 and Shannon-Wiener index of endophytic fungi isolated from Fuzhou was 2.13 which were the highest in the 5 sites, respectively. By dual-culture test, only Trichoderma harzianum ND-13 exhibited antifungal activity against Calonectria pseudoreteaudii. Colony of C. pseudoreteaudii was covered with T. harzianum ND-13 in dual-culture. Microscopic observation showed that ND-13 mycelia could enwind C. pseudoreteaudii hyphae. The study found that ND-13 did not produce chitinase, but β-glucanase. The results showed that the diversity of endophytic fungi in Eucalyptus leaves was high, and ND-13 had the potential to control the Calonectria leaf blight (CLB) of Eucalyptus spp.; and it was feasible to obtain biocontrol agents of CLB from Eucalyptus endophytic fungi.
Key words: endophytic fungi     diversity     Trichoderma     Calonectria leaf blight     biological control    

桉树(Eucalyptus spp.)是全球范围内广泛种植的速生树种, 虽然我国桉树林仅占全国森林总面积的2.5%,但是生产出的木材约占全国木材总产量的25%,年总产值超过1 000亿元[1]。桉树焦枯病(Calonectria leaf blight, GLB)是全球桉树种植区广泛分布的病害,我国于1992年在广东省高要市首次发现该病,目前已成为威胁我国桉树产业的重要病害之一[2]。目前,国内外诸多学者对桉树焦枯病的防治方法进行了一系列的研究,建立了化学防治、引进抗病树种等治理方法,其中化学防治最为有效,但仅限于苗圃使用,在森林中由于化学农药使用的经济性差并且存在环境污染问题而很少被采用[3]。生物防治方法也被尝试用于该病的防治,分离自土壤的假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)对该病有一定防治效果,但防治效果不稳定,还处在探索阶段[4]

植物内生菌是植物病害生物防治的天然候选者[5]。近年来,使用植物内生菌防治林木病害的研究日益增多,尤其集中在重要树种上, 如从热带的可可树中获得的2株拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、1株弯孢属(Curvularia)、1株弯颈霉属(Tolypocladium)、3株镰刀菌属(Fusarium)内生真菌均具有防治可可黑荚病的潜力[6];温带杨树内生细菌短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)JK-SX001可用于防治杨树溃疡病[7];寒带重要造林树种欧洲云杉内生真菌(Phialocephala sphaeroides)拥有抑制小孔异担子菌(Heterobasidion parviporum)的能力[8]。国外对于桉树内生菌已有较为详细的研究,发现不同种类、不同地区的桉树的内生菌种群结构存在差异[9-10]。中国桉树内生真菌虽有过相关研究[11],但内生真菌多样性尚没有较为完整的评估,对不同地区桉树内生真菌种群结构以及针对桉树病害防治的开发利用研究甚少。鉴于此,以福建省5个地点桉树人工林为材料,通过分离桉树叶片内生菌,探明福建省桉树叶片内生真菌的多样性,同时针对桉树焦枯病防治,筛选获得拮抗桉树焦枯病菌(Calonectria pseudoreteaudi)的内生菌菌株,并探究其作用机制。研究结果有利于丰富内生菌防治植物病害的工作,为生产上防治桉树焦枯病提供生物防治因子,应用后将减少化学农药使用,具有重要的经济效益和生态学意义。

1 材料与方法 1.1 样品的采集与前处理

在福建省福州(26°04′N,119°14′E)、南平(26°46′N,117°18′E)、漳州(24°40′N,117°43′E)、龙岩(25°37′N,116°22′E)和宁德(26°46′N,119°33′E)5个地区的桉树人工林,选择健康4年生桉树叶片作为内生真菌分离的样品。每次随机选择5株健康的桉树采集样品,置于实验室进行前期处理,洗净叶片表面的灰尘等附着物,置于干燥的滤纸上,吸干表面的水分,备用。

1.2 内生真菌的分离

分离培养基为马铃薯葡萄糖培养基(potato dextrose agar,PDA),即:200 g去皮马铃薯,20 g葡萄糖,12 g琼脂粉。将备好的桉树叶片切成2 cm×2 cm的方块并按以下程序进行表面消毒:75%的酒精对样本消毒10 s后,用3%的NaClO消毒1 min,再用75%的酒精消毒10 s,最后用无菌水漂洗3次。将消毒完成的样品贴于PDA平板上轻轻按压后,取下并将该平板作为对照用以检测消毒效果。将消毒后的样品边缘剪掉约5 mm,剩下的部分剪成4片边长约5 mm×5 mm的小块,放置无菌的吸水纸上吸干水分后,将小块放置在PDA平板上。将上述平板放置在25 ℃培养箱中培养,每天观察是否有新的真菌长出,连续观察30 d,并及时挑取新长出的真菌菌丝接种到新的PDA平板。已获得的真菌菌落通过纯化后,用无菌的25%甘油,于-80 ℃冰箱冷冻保存。

1.3 内生真菌的鉴定 1.3.1 形态鉴定方法

将冻存于-80 ℃冰箱中的内生真菌接种于PDA平板上,25 ℃恒温培养,对菌株进行活化。待菌株长出新鲜菌丝,用接种针挑取菌落边缘新鲜菌丝块接种至新的PDA平板上,放置于25 ℃培养箱中培养,待菌落长满培养皿,观察并描述菌落特征,显微镜下观察真菌菌丝、孢子形态等,对菌株进行形态学鉴定。

1.3.2 分子鉴定方法

将活化后的内生真菌接种到铺有一层灭菌玻璃纸的PDA平板上,待菌丝长满平板,收集菌丝,利用CTAB法提取内生真菌的DNA[12]。得到的DNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳检测,并用分光光度计测量DNA浓度,将DNA的浓度稀释为50 ng · μL-1,贮存在-20 ℃冰箱中保存备用。

采用50 μL PCR体系,使用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增真菌rDNA内部转录间隔序列(internal transcribed spacer,ITS)。PCR程序为:第一步94 ℃预变性5 min,第二步94 ℃变性1 min,第三步54 ℃退火1 min,第四步72 ℃延伸30 s,第二步至第四步循环30次,第五步72 ℃延伸10 min,最后16 ℃保存。

PCR产物纯化以后进行测序。将测序结果使用NCBI的BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对分析,选择相似度最高的且已经发表的序列信息,确定所比对菌株的分类地位。应用MEGA 7.0软件的Maximum Likelihood计算方法对内生菌菌株及参考菌株序列进行聚类分析,重复计算次数设为1 000次。

1.4 内生真菌优势种类及多样性统计

根据卡玛戈指数(Camargo index,IC)计算桉树叶片内生真菌的优势种类,计算公式为:

$ {I_C} = 1/S $ (1)

式中:S为种类丰富度(species richness),代表每个环境所拥有的种类的数量,若1/S小于某个种类在该群落的权重Pi, 这个种类则被确定为优势种类,Pi计算公式为:

$ {P_i} = {n_i}/N $ (2)

式中:ni代表某种类的菌株数量,N代表该环境中所有种类的菌株数量。

分别使用香农-威纳指数(Shannon-Wiener index,H)和辛普森指数(Simpson index,D)评估桉树叶片内生真菌的多样性。香农-威纳指数的计算公式为:

$ H = \sum\limits_s^{i = 1} {({P_i}{\rm{ln}}{P_i})} $ (3)

辛普森多样性指数的计算公式为:

$ D = 1 - \sum\limits_s^{i = 1} {\frac{{{n_i}({n_i} - 1)}}{{N\left( {N - 1} \right)}}} $ (4)
1.5 拮抗菌株的筛选

采用对峙培养法进行拮抗菌株筛选,用打孔器分别在新鲜的桉树焦枯病菌和桉树内生真菌菌落边缘打取直径6 mm的菌丝块并接种在PDA两边。桉树焦枯病菌菌丝块与内生真菌菌丝块相距5 cm。接种后的平板放置在25 ℃恒温培养箱中培养15 d,观察内生真菌对焦枯病菌生长的抑制情况。将有抑菌活性的内生真菌进一步复筛。桉树焦枯病病原菌为本实验室分离鉴定并保存的菌株。

1.6 作用机制研究

选择实验室保存的生长正常、致病力强的桉树焦枯病菌菌株作为抑菌试验对象。将前期试验筛选出的拮抗菌株哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ND-13与桉树焦枯病菌接种到同一个铺有无菌玻璃纸的PDA平板的两边,相距5 cm,放置在25 ℃的培养箱中培养,待两个菌落相交,木霉菌丝伸长进桉树焦枯病菌菌落约1 cm,切取交界地方的玻璃纸到载玻片上,用光学显微镜观察对峙菌株之间的菌丝形态。

使用胶体几丁质平板透明圈法检测哈茨木霉ND-13产生几丁质酶的情况。胶体几丁质的制备参照陈三凤等[13]方法,含胶体几丁质的PDA检测平板参照陶刚等[14]方法制作。从新鲜的哈茨木霉ND-13菌落边缘打取直径6 mm的菌丝块,接种到检测平板上,28 ℃下恒温培养,并观察是否产生透明圈。

采用葡聚糖-刚果红检测培养基,检测ND-13产生β-葡聚糖的能力。培养基配方为:β-葡聚糖(70%含量) 2 g,NaNO3 3 g,K2HPO4 l g,KCl 0.5 g,MgSO4 · 7H2O 0.5 g,FeSO4 · 7H2O 0.01 g,去氧胆酸钠0.6 g,4 g · L-1的刚果红溶液30 mL,琼脂粉12 g,蒸馏水定容至1 000 mL,121 ℃高压灭菌后备用。从新鲜的哈茨木霉ND-13菌落中打取直径6 mm的菌丝块,接种在刚果红检测培养基上,28 ℃恒温培养,观察哈茨木霉ND-13菌落边缘是否出现透明圈。

2 结果与分析 2.1 桉树叶片内生真菌的种群结构

从样品中总共分离到内生真菌87株,其中,从南平地区的样品中分离到的内生菌菌株数量最多,为24株,其次是福州,为23株,漳州15株,宁德13株,龙岩12株。通过分子生物学手段结合形态观察鉴定,初步确定87株内生真菌属7目及2个未定目,其中包含15属及1个未定属,20种和1个未确定种(图 1)。其中,分离到的Pseudoplagiostoma eucalypti,葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)3种的分离频率超过内生真菌菌株总数的卡玛戈指数0.05(表 1),为桉树叶片内生真菌的优势种群,而P. eucalypti的分离频率最高,为0.32。

图 1 用Maximum Likelihood方法构建的桉树叶片内生真菌的ITS聚类分析 Fig. 1 ITS cluster analysis tree of endophytic fungi associated with Eucalyptus leaves by Maximum Likelihood method
表 1 5个地点桉树叶片内生真菌的多样性 Table 1 Diversity of endophytic fungi on Eucalyptus leaves in five place of Fujian province
目Order 种Species 真菌菌株数量Number of fungal strain Pi
福州
Fuzhou
南平
Nanping
龙岩
Longyan
漳州
Zhangzhou
宁德
Ningde
总数
Total
座囊菌目Dothideales 葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea 1 1 4 6 0.07
Neofusicoccum parvum 1 2 3 0.03
Neofusicoccum umdonicola 1 1 0.01
叶点霉Phyllosticta capitalensis 2 1 1 4 0.05
间座壳目Diaporthales Pseudoplagiostoma eucalypti 11 1 6 10 28 0.32
肉座菌目Hypocreales 哈茨木霉Trichoderma harzianum 1 1 0.01
未定目Incertae-sedis 不定种Endophytic fungus ND-10 1 1 0.01
球壳亚纲未定目Sordariomycetidae 尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum 1 1 0.01
博宁炭疽菌Colletotrichum boninense 2 1 3 0.03
胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides 9 1 2 12 0.14
格孢腔菌目Pleosporales 弯孢属Curvularia sp. 1 1 0.01
球壳孢目Sphaeropsidales 拟茎点霉Phomopsis sp. 1 1 1 1 4 0.05
假毛球壳目Trichosphaeriales 黑孢属Nigrospora sp. 3 3 0.03
炭角菌目Xylariales 光轮层炭壳菌Daldinia eschscholtzii 3 1 4 0.05
山地炭团菌Hypoxylon monticulosum 2 2 0.02
炭团菌Hypoxylon sp. 2 2 0.02
双乳突炭曾菌Nemania bipapillata 1 1 2 0.02
橄榄小孢拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora 3 3 0.03
座坚壳属Rosellinia sp. 1 1 0.01
木生炭角菌Xylaria arbuscula 1 1 0.01
炭角菌Xylaria sp. 1 2 1 4 0.05
菌株总数量Total isolates number 23 24 12 15 13 87
种类丰富度Species richness 11 10 8 6 4 21
卡马戈指数Camargo index 0.09 0.1 0.13 0.17 0.25 0.05
香农-威纳指数Shannon-Wiener index 2.01 1.83 1.98 1.59 0.79 2.47
辛普森指数Simpson index 0.84 0.78 0.92 0.79 0.42 0.87
2.2 内生真菌的多样性

分别对5个采样点的样品内生真菌多样性进行统计表明,福州采样点桉树叶片内生真菌的种类丰富度最大,23株内生真菌鉴定为11种,其次是南平桉树叶片内生真菌,24株内生真菌鉴定为10种(表 1)。香农-威纳指数显示福州采样点桉树内生真菌的香农-威纳指数为2.01,多样性高于其他地区的桉树样品。辛普森多样性指数显示,宁德采样点桉树叶片内生真菌种类少,没有多样性,其它地区内生真菌存在较高的多样性,尤其是龙岩地区辛普森多样性指数为0.92,表明龙岩地区桉树叶片内生真菌种类丰富。综合所有样品的内生真菌数量和种类,辛普森多样性指数为0.87,同样显示了桉树叶片内生真的多样性。

2.3 拮抗菌株抑菌作用

通过平板对峙培养,从分离到的87个菌株中筛选到的哈茨木霉ND-13能够覆盖桉树焦枯病菌菌落,抑制其生长,且致使桉树焦枯病菌的菌落萎缩,哈茨木霉菌ND-13布满整个培养皿,占据全部空间,并在桉树焦枯病菌菌落上产生大量分生孢子(图 2)。通过显微镜观察,哈茨木霉ND-13的菌丝能够缠绕桉树焦枯病菌的菌丝(图 3)。

图 2 哈茨木霉ND-13对桉树焦枯病菌的抑制 Fig. 2 Antifungal activity of Trichoderma harzianum ND-13 against Calonectria pseudoreteaudii
图 3 哈茨木霉ND-13对桉树焦枯病菌菌丝的缠绕 Fig. 3 Enwinding of T. harzianum ND-13 againest C. pseudoreteaudii hyphae

通过胶体几丁质平板检测,哈茨木霉ND-13菌落周围不能形成透明圈,显示ND-13无几丁质酶分泌。但在含有β-葡聚糖的平板上,ND-13菌落周围能够形成明显的透明圈,说明ND-13能够产生β-葡聚糖(图 4)。

图 4 β-葡聚糖酶的活性检测 Fig. 4 Detection of β-glucanase activitie
3 讨论与结论

内生菌的种类多样性及其生态学作用,如促进宿主植物生长、增强植物修复功能、增加宿主对环境胁迫的抗性等,都是内生菌研究的重点[15],植物内生菌普遍存在于多种环境中的各类植物,尤其是热带树木内生菌,拥有较高的多样性[16-17]。国外对不同种、不同地区的桉树已有较为系统的研究,相对国外,虽然中国桉树内生真菌,内生细菌都有过相关研究[12, 18],但是桉树内生菌种群结构以及开发利用的研究晚且少,内生真菌多样性尚没有较为系统完整的评估。对福建省5个地区人工林桉树叶片内生真菌的多样性进行了初步研究,研究表明:桉树叶片内生真菌存在丰富的多样性,这与KHARWAR et al[19]以及SÁNCHEZ MÁRQUEZ et al[20]关于桉树叶片内生真菌多样性的研究结果相似,都表明桉树叶片内生真菌拥有丰富的多样性。与之不同的是,本研究发现Pseudoplagiostoma eucalypti,葡萄座腔菌和胶孢炭疽菌是桉树叶片内生真菌的优势种群;而从印度瓦拉纳西柠檬桉(Eucalyptus citriodora Hook.f.)叶片分离的内生真菌中灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、支孢样支孢霉(Cladosporium cladosporioides)、Oidiodendron clamydosporum分离频率最高,占有优势地位[19];SNCHEZ MRQUEZ et al[20]所研究的蓝桉(Eucalyptus globulus Labill.)桉树叶片内生真菌中Phaeomoniella sp.是优势种类,将柠檬桉、蓝桉与本研究结果相比较,发现各自的内生真菌种群结构也不相同,出现这样现象可能的原因,一是每一组所分离的内生菌或许都不是全部的桉树内生菌,所采用的分离技术和培养条件不一样导致所获得的内生真菌种类不同;二是不同种植物、不同经纬度、不同海拔的植物内生菌种类存在明显的差异[21]。宁德地区辛普森多样性指数较低,可能原因是获得的菌株数量较少,不能反映叶片内生真菌的实际情况,需要进一步采样分离。本研究仅采用组织分离法分离桉树内生真菌,为获得尽可能多的内生真菌种类,更加切实的反应桉树内生真菌的种群结构,在后续的研究中应该增加使用其他的分离方法,比如组织匀浆法、组织离心法。

生物防治被认为是最具潜力的环境友好型植物病害防治措施,也被认为是森林病虫害防治的重要研究方向[22],植物内生菌已经被认为是植物病害生物防治因子的重要来源[5]。有研究发现桉树内生真菌亦具有抗菌活性,从桉树中分离的内生真菌对新月弯孢菌(Curvularia lunata)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeroginosa)等多个人类病原菌有抑制效果[19, 23]。因而从桉树内生真菌中获取具有抗菌活性的菌株用于防治桉树或其他植物病害是桉树内生真菌研究的重要方向,已有报道桉树内生真菌能够抑制支孢样支孢霉(Cladosporium cladosporioides)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的生长。本文从87株内生真菌中仅获得1株能够对桉树焦枯病菌有抑制作用的菌株——哈茨木霉ND-13。木霉属真菌是著名的植物病害生防菌[24-25],在防治由丽赤壳属真菌引起的植物病害亦有研究,哈茨木霉T22能够有效降低由Calonectria pauciramosa引起的观赏植物的冠瘿病和根腐病,拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)Mb2能有显著降低由Calonectria pseudonaviculata引起的黄杨木的枯萎病[26-27]。目前,木霉的抗菌作用机制至少有6种:抗菌代谢产物的杀菌作用、重寄生作用、溶菌作用、毒性蛋白、竞争作用和蛋白酶的作用[24]。通过显微镜观察,ND-13菌丝可以抑制桉树焦枯病菌菌落的生长,哈茨木霉ND-13可以寄生桉树焦枯病菌菌丝,发挥抑菌作用。经过几丁质酶、β-葡聚糖酶检测,证明ND-13通过产生β-葡聚糖酶发挥溶菌作用。

综上所述,桉树叶片存在种类丰富的内生真菌,从中筛选用于桉树病害生物防治的菌株是可行的。本研究为哈茨木霉防治桉树焦枯病奠定了理论基础。

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