实时荧光定量聚合酶链式扩增反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)的特点是灵敏度高、特异性强、重复性好，在RNA低丰度的转录分析中优势明显^[1]。进行RT-qPCR时需使用内参基因对试验数据进行校正，以消除样品间因RNA提取效率、纯度及不同完整性造成的误差^[2]，但内参基因在不同试验条件下转录水平存在明显的差异，影响RT-qPCR分析的准确性^[3]。理想的内参基因要求不受任何内、外源因素的影响，在不同的试验因素与环境下均能稳定表达^[4]。然而，目前尚未有内参基因可以在不同条件下皆可稳定表达，因此在进行RT-qPCR试验前，筛选出特定试验条件下表达稳定的内参基因至关重要^[5]。

桉树(Eucalyptus spp.)具有速生、丰产、轮伐期短等特点，是优良的纸浆用材，经济效益十分显著^[6]。桉树焦枯病(Calonectria leaf blight)是热带和亚热带桉树种植区危害最为严重的病害之一，严重威胁桉树产业的发展^[7]。桉树焦枯病是由丽赤壳属(Calonectria)真菌引起的病害，Calonectria pseudoreteaudii是福建省内发现最早、分布最广、致病力最强的菌株, 其无性态为帚梗柱孢属(Cylindrocladium) ^[8-9]。6—9月(高温高湿季节)是桉树焦枯病的高发期，苗圃和4年生以下幼林受害尤为严重，造成桉树大面积死亡^[10]。近年来，本课题组对福建省桉树焦枯病原进行了鉴定，对前期筛选的致病力最强菌株C.pseudoreteaudii全基因组及部分基因家族进行了鉴定，为从分子生物学角度探索桉树焦枯病菌的致病机理奠定了基础^{[8, 11-12]}。RT-qPCR可从基因水平对致病相关基因的功能进行验证，而选择表达稳定的内参基因是利用RT-qPCR预测基因功能的先决条件。因此，选择3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、α-微管蛋白基因-1 (α-tubulin-1)、α-微管蛋白基因-2 (α-tublin-2)、18S核糖体RNA基因(18S rRNA)、多聚泛素酶基因(ubiqutin)、肌动蛋白基因(β-actin)、β-微管蛋白基因(β-tubutin) 7个持家基因作为候选内参基因，它们高度保守并且在大多数情况下持续表达，表达水平受环境因素影响较小。分析不同候选内参基因在不同浓度的盐胁迫及焦枯病菌侵染桉树叶片两个条件下的差异表达情况，并通过geNorm软件对基因的表达稳定性进行分析，进而筛选出合适的内参基因，以及对目的基因RT-qPCR数据进行标准化，探索桉树焦枯病菌在高渗透压及侵染条件下基因表达的分子机制，为基因的功能验证奠定基础，对其他丽赤壳属菌种选择参考基因具有参考价值。

1 材料与方法 1.1 试验材料

桉树焦枯病菌(Calonectria pseudoreteaudii；菌株：YA51)和桉树抗焦枯病品系尾细桉(Eucalyptus urophylla ×E.tereticornis)叶片由福建农林大学森林保护研究所提供。YA51基因组已上传至美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology information，NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)编号为MOCD01000000。

1.2 试验方法 1.2.1 样品处理

NaCl胁迫处理：将桉树焦枯病菌YA51接种于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基中，然后放入28 ℃恒温箱中培养7 d。刮掉菌丝，24 h后用无菌水清洗PDA平板并制成孢子悬浮液(2×10⁵个· mL^-1)，接种于分别含有浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4 mol · L^-1NaCl的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，置于恒温振荡器(28 ℃，离心半径26 mm, 150 r · min^-1)中培养12 h。用4层纱布滤下菌丝，用锡箔纸包裹后液氮速冻，放入-80 ℃冰箱中保存，备用。

桉树焦枯病菌侵染桉树叶片处理：取2 g桉树叶片加入2 mL无菌水研磨成浆，离心后取上清液，用细菌过滤器过滤上清液，与PDA培养基摇匀，待凝固后铺上玻璃纸，在平板中加入300 μL孢子悬浮液(2×10⁵个· mL^-1)，并用涂布器均匀涂布。以未加入桉树研磨上清液的PDA培养基接入焦枯病菌作为对照组。在48 h后，用锡箔纸将菌丝及玻璃纸一同包裹后液氮速冻，放入-80 ℃冰箱中保存，备用。以上每个处理设3个重复。

1.2.2 总RNA提取及质量检测

利用RNAprep Pure Plant Kit (TIANGEN)试剂盒提取7种处理下各桉树焦枯病菌菌丝总RNA。超微量分光光度计(Denovix)测定总RNA的浓度，测得浓度为200~507 μg · μL^-1，经质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，结果显示所有处理3条带均清晰无拖带，无DNA和其他杂质污染。

1.2.3 反转录PCR

根据FastQuant cDNA第一条链合成试剂盒说明书，以mRNA为模板进行反转录PCR，反应体系为20 μL，包括5×gDNA Buffer 2 μL，总RNA 3 μL，RNase-Free ddH₂O补足10 μL；42 ℃孵育3 min后冰浴；第1轮反应结束后，在PCR管中再加入10×Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH₂O补足20 μL；42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min。反应结束后加入180 μLRNase-Free ddH₂O，-20 ℃保存。

1.2.4 内参基因的引物设计和特异性检测

所有的候选内参碱基序列均来自桉树焦枯病菌转录组数据。引物采用Beacon Designer7软件设计，委托上海生工生物工程公司合成，引物序列如表 1所示。以cDNA为模板进行PCR扩增，检测引物对桉树焦枯病菌cDNA的扩增特异性，其反应体系为：10×PCR Buffer2.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，TaKaRaTaqTM 0.3 μL，cDNA 1 μL，ddH₂O 17.2 μL。94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物在质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链式扩增反应

采用TransStart Tip Green RT-qPCR SuperMix (TRANSGEN)试剂盒，反应体系包括2×Talent RT-qPCR PreMix 10 μL，正向引物0.6 μL，反向引物0.6 μL，cDNA模板0.3 μL，50×ROX×Reference Dye0.4 μL，RNase-Free ddH₂O 7.4 μL。95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸15 s，40个循环。

1.2.6 数据处理与分析

将cDNA模板依照顺序稀释4个梯度，每个梯度稀释5倍，通过RT-qPCR进行扩增。采用软件QuantStudio (TM) Real Time PCR Softwave v1.0绘制出7个候选内参基因的标准曲线，从而得到引物的溶解温度、斜率(k)、引物扩增效率等相关参数，再计算引物扩增效率(E)，

$ E = ({10^{ - \frac{1}{k}}} - 1) \times 100。$

根据7个内参基因在桉树焦枯病菌不同浓度NaCl胁迫下和桉树焦枯病菌侵染桉树叶片48 h条件下的循环阈值(C_t)，通过Excel软件取得相对表达量(Q)，Q=2^-△C_t，其中△C_t=某基因各样本的C_t－某基因最小C_t^[13]，将Q导入geNorm软件对候选内参基因的表达稳定性进行相应的统计学分析，进而筛选出不同情况下最优的内参基因，最终进行综合评价筛选。

2 结果与分析 2.1 引物特异性及扩增效率

为检测所合成引物的特异性，以cDNA为模板进行PCR的扩增，扩增产物在质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果表明, 7个候选内参基因扩增的片段与预期的大小是一致的，电泳条带是清晰且单一的，并且没有发生引物二聚体的情况，引物具有较好的特异性。

7个候选内参基因的标准曲线相关参数及扩增效率如表 1所示。7个内参基因的线性相关系数(R²)的变化范围0.960~0.998，扩增效率90.5%~123.0%，符合RT-qPCR对扩增效率的要求。

2.2 候选内参基因的表达水平

C_t是每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。各模板的C_t与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，C_t越小，起始拷贝数越多，基因表达量越高，反之亦然。候选内参基因的表达水平箱线图(Box plot)如图 1所示，方块下沿表示第一四分位数，方块上沿表示第三四分位数，即50%的C_t在方块范围内，方块内的横线代表中位数，竖线两端代表最大值和最小值。NaCl胁迫下7个候选内参基因的C_t在19.2~31.8，其中ubiquitin表达量最高，α-tubulin-2表达量最低。侵染条件下7个候选内参基因的C_t在23.0~34.4，18S rRNA表达量最高，α-tubulin-2表达量最低。

2.3 候选内参基因的稳定性分析

通过geNorm软件计算各候选基因的平均表达稳定性值(M)，去除M最大的一个基因，然后再重新计算剩余候选基因的M，再去除M最大的基因，依此类推，直到剩下最后两个最稳定的基因，即得出最优的内参基因组合^[14]。geNorm软件M的取舍值为1.500，M越小，基因的稳定性越高，反之则越低。结果表明, 不同浓度NaCl胁迫下桉树焦枯病菌7个内参基因的表达稳定性排序为GAPDH (0.713) < β-tubutin (0.512) < 18S rRNA (0.448) < α-tubulin-1 (0.379) < β-actin (0.337) < ubiquitin/α-tubulin-2 (0.234)，所有候选内参基因的M均在1.500以内。其中，ubiquitin和α-tubulin-2的M最小，最为稳定；桉树焦枯病菌侵染叶片48 h条件下，7个内参基因的表达稳定性排序为α-tubulin-2 (1.330) < β-tubulin (0.849) < β-actin (0.658) < ubiquitin (0.563) < GAPDH (0.506) < 18S rRNA/α-tubulin-1 (0.264)，所有候选内参的M均在1.500以内。以18S rRNA和α-tubulin-1最为稳定。

用单一的参考基因进行校正可能会产生显著的误差，因此，需要1个以上的参考基因。然而，有研究人员指出多个参考基因可能增加试验的不稳定性和复杂性^[15-16]。因此，配对变异值(V_n/n+1)成为评估参考基因最佳数量的重要指标^[17]。通过geNorm软件计算V_n/n+1，当V_n/(n+1) < 0.150时, 则无需引入新的基因；当V_n/(n+1)>0.150时，则需引入第n+1个基因。7个候选内参基因的配对变异值(表 2)显示，在NaCl胁迫下V_2/3 =0.124 < 0.150，所以不需要引入第3个基因，最适参考基因为ubiquitin和α-tubulin-2；在侵染条件下，V_3/4 < 0.150 < V_2/3，需要引入第3个基因，最适参考基因为18S rRNA、α-tubulin-1和GAPDH。

3 讨论与结论

在分子生物学研究过程中，RT-qPCR技术已经成为其重要的工具，稳定的内参基因、合理的试验设计、扩增效率良好的引物及严格的试验操作等因素均影响基因表达的正确性^[18]。采用RT-qPCR技术，通过系统检测桉树焦枯病菌的GAPDH、α-tubulin-1、α-tubulin-2、18S rRNA、ubiquitin、β-actin、β-tubulin)共7个候选内参基因，在不同浓度盐胁迫(0.1、0.2、0.3、0.4 mol · L^-1NaCl)和桉树焦枯病菌侵染桉树叶片两种条件下mRNA的差异表达情况，从表达水平可以看出，相同的基因在不同试验条件下的表达情况并不相同。采用geNorm软件计算各候选基因的平均表达稳定性值(M)和配对变异值(V_n/n+1)，发现来源于同一家族的基因如α-tubulin-1和α-tubulin-2在同样的试验条件下稳定性存在差异，进一步说明筛选内参基因的重要性。最终筛选得到ubiquitin和α-tubulin-2为桉树焦枯病菌在NaCl胁迫下较适合内参基因，及18S rRNA、α-tubulin-1和GAPDH为侵染条件下较适合内参基因。这为运用RT-qPCR技术探索桉树焦枯病菌基因功能时数据的标准化提供了一个参考。

持家基因是维持细胞基本生命活动所必需的，并存在于所有真核细胞中，在动物、植物及真菌中作为内参基因应用广泛。α-tubulin常被用作真菌分子生物学及植物研究的内参基因，如交链孢MG1 (Alternaria sp.MG1)在不同发育阶段^[19]、甘蔗接种黑穗病菌(Tilletia controversa Kuhn)后不同时间的基因表达分析^[20]。β-actin也是广泛使用的内参基因，如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)在不同生长温度^[21]、刺糙青霉(Penicillium echinulatum)在诱导和抑制生长^[22]、黄色霉菌(Talaromyces marneffei)在正常生长和H₂O₂胁迫^[23]条件下，β-actin作为最适内参基因之一。β-tubutin是龙眼焦腐病菌(Lasiodiplodia theobromae)在高温胁迫^[24]、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)在黑暗^[21]条件下生长的最适内参基因。除本试验的候选内参基因，转录延伸因子(ef-1) ^[25]、亲环素类肽酰脯氨酰顺反异构酶B前体(Cyp) ^[26]和28S核糖体RNA基因(28S rRNA) ^[27]等也是常用的内参基因。此外，利用转录组数据选择稳定表达的基因也是选择候选内参基因的一种手段^[28]。对桉树焦枯病菌在特定试验条件下内参基因筛选进行研究，可为研究桉树焦枯病菌基因表达差异提供重要的试验依据。