油茶(Camellia oleifera Abel.)为山茶科山茶属植物，是我国重要的木本油料树种，与油橄榄(Olea europaea L.)、油棕(Elaeis guineensis Jacq.)、椰子(Cocos nucifera L.)并称“世界四大木本油料树种” ^[1]。油茶种子所榨茶油不易酸败，耐贮存，以油酸、亚油酸为主的的不饱和脂肪酸含量高达90%以上，并含有类胡萝卜素、茶多酚、角鲨烯等活性营养成分，是联合国粮农组织重点推广的高级食用植物油^[2]。生理落果是降低油茶林经营效益的重要影响因子，主要由3部分组成，分为幼果时期的生理落果、病虫害导致的落果以及采前落果^[3]。果实的生长发育从受精开始，经历果实生长、成熟和衰老，在此期间，果实内细胞不断进行分裂、膨大，并不断进行营养物质的积累、转化^[4-5]。果实的发育成熟经历着一系列复杂的代谢变化，是一系列相关基因时空表达以及相互作用的结果^[6]。目前，关于油茶果实的研究大多集中在表型性状研究、脂肪酸组成分析、病虫害防治以及生理后熟等^[7]。

蛋白质组学以蛋白质组为研究对象，通过大规模、高通量的研究分析蛋白质组的蛋白质表达量、功能变化^[8]。将蛋白质组学技术应用于果实生长发育的研究，通过大规模、高通量的分析果实生长发育相关的蛋白质表达水平变化，能较好地揭示相应的生物学机制。占志勇^[9]运用蛋白质组学方法研究油桐种仁不同发育时期的差异表达蛋白，发现油桐油脂含量由一系列参与脂肪酸代谢的蛋白(酶)共同决定的。曹尚银等^[10]运用双向电泳技术研究石榴果实发育成熟期果皮的代谢过程，发现细胞色素b6-f复合体、叶绿素a/b结合蛋白和果糖激酶2-like可能与果皮颜色变化相关; 半胱氨酸合酶可能参与提高石榴的抗氧化胁迫能力。耿姣姣^[11]运用差异蛋白质组学技术研究乙烯和1-MCP调控番木瓜果实成熟的过程, 得出多聚泛素基因受乙烯的诱导增加表达量, 从而参与调控番木瓜果实的成熟衰老的相关结论。双向电泳技术为蛋白质组学的基本技术，是基于不同蛋白质等电点和分子量的差别而实现蛋白质的分离，由于不同树种或组织的蛋白质组变化较大，为顺利获得较为清晰的双向电泳图谱，体系优化必不可少^[12]。鉴于此，拟从样品制备、IEF聚焦程序设定、聚丙烯酰胺凝胶浓度SDS-PAGE 3个方面优化油茶种仁双向电泳体系，以期建立一套适合普通油茶种仁双向电泳的体系，为深入开展油茶蛋白质组学提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验样品采自福建省福州市桐口国有林场的普通油茶优良无性系‘闽43’的成熟果实^[13]，剥取种仁，将种仁置于液氮中贮存并带回实验室分析。

1.2 主要仪器与试剂

主要仪器: Ettan IPGphor 3等电聚焦仪、ETTAN DALTsix垂直电泳槽、MultiTemp Ⅲ循环水浴、ESP601电源、Image Scanner Ⅲ扫描仪、Beckman AJ-30i超高速冷冻离心机、TU-1810紫外可见分光光度计等。

主要试剂:尿素、硫脲、Tris、甘油、甘氨酸、DTT(DL-Dithiothreitol)、碘乙酰胺、pH值3~11 NL IPG胶条、CHAPS、SDS、pH值8.0饱和酚、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、无水NaCO₃、TEMED、过硫酸铵、AgNO₃、无水硫代硫酸钠等，以上试剂均为分析纯。

1.3 研究方法 1.3.1 油茶种仁蛋白提取

称取油茶种仁样品1 g置于预冷的研钵中，加入10%PVPP和适量石英砂，用液氮快速充分研磨成白色粉末状。

① TCA/丙酮法:参考SHEORAN et al^[14]与DAMERVAL et al^[15]的方法并改进。往样品中加入6 mL蛋白提取液，涡旋震荡，-20 ℃沉淀过夜；4 ℃，20 000 r · min^-1离心15 min，弃上清液，5倍体积的冷丙酮(含0.07% β-巯基乙醇)洗涤沉淀两次，冷冻干燥得到白色蛋白干粉，-80 ℃保存。

② Tris-Hcl酚抽法:参考VINCENT et al^[16]方法并改进。往样品中加3 mL蛋白质提取液及等体积pH值8.0的饱和酚，4 ℃震荡30 min；4 ℃，20 000 r · min^-1离心15 min，取上层酚相，加入相同体积的蛋白提取液，重复1次，取酚相加入4倍体积的含0.1 mol · L^-1乙酸铵的甲醇溶液，-20 ℃静置2 h，以沉淀蛋白质，4 ℃，20 000 r · min^-1离心15 min，弃上清液，用2倍预冷的甲醇溶液清洗蛋白沉淀，轻微混匀后，4 ℃，20 000 r · min^-1离心10 min，使用丙酮溶液代替甲醇溶液重复清洗一次，沉淀冷冻干燥后可得油茶种仁蛋白干粉。

③ TCA/丙酮+SDS酚抽法:参考WANG et al^[17-18]的方法并改进。往样品中加入3 mL SDS蛋白提取液及等体积pH值8.0饱和酚，4 ℃震荡30 min；4 ℃，20 000 r · min^-1离心15 min，取上层酚相，加入4倍体积的含0.1 mol · L^-1的乙酸铵的甲醇溶液，-20 ℃静置2 h沉淀蛋白质，使用甲醇溶液、丙酮溶液清洗样品蛋白沉淀1遍，离心时间设置为5 min，其他操作步骤同Tris-Hcl酚抽法。

1.3.2 油茶种仁蛋白沉淀的裂解

取40 mg蛋白干粉，加入2 mL裂解液，涡旋震荡后，超声波冰浴裂解20 min，期间每隔3 min混匀1次，直至蛋白溶解完全后，4 ℃，25 000 r · min^-1离心15 min，取上清液分装，即为蛋白样品。

1.3.3 油茶种仁蛋白定量

参照BRADFORD^[19]法测定油茶种仁样品蛋白浓度，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)作标准曲线。

1.3.4 水化上样

根据蛋白定量结果确定相应的上样量，加入水化液，选用24 cm pH值3~11 NL IPG胶条，20 ℃主动水化20 h。

1.3.5 第一向等电聚焦分离

参考邱智敏等^[20]油茶雌蕊双向电泳体系，试验设置2种不同等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)程序进行第一向等电聚焦分离，程序设置见表 1。

1.3.6 胶条平衡

平衡一:将等电聚焦结束后的胶条转移至平衡管，加入含0.1 g DTT的平衡液，黑暗条件下摇床平衡15 min；平衡二:将平衡一结束后的胶条转移至新平衡管，加入含0.25 g碘乙酰胺的平衡液，黑暗条件下摇床平衡15 min。

1.3.7 第二向SDS-PAGE

配置8%、10%两种凝胶浓度的SDS凝胶进行SDS-PAGE，参数设定如下:每胶10 mA, 600 V，100 W，16 ℃，电泳1 h；每胶30 mA，600 V，100 W，16 ℃，电泳至溴酚蓝指示线迁移至距胶面底部0.5 cm处。

1.3.8 凝胶染色、扫描、分析

采用硝酸银染色法进行染色，Image Scanner Ⅲ扫描仪进行凝胶扫描，Image Master 2D Platinum 5.0进行图像分析。

2 结果与分析 2.1 不同蛋白提取方法结果对比

不同蛋白提取方法对双向电泳影响较大(图 1)。通过TCA/丙酮法所提取的样品蛋白分离的较为清晰，但是蛋白点相对较少；通过酚抽法提取的蛋白点相对TCA/丙酮法的多，但是酸性端的蛋白分离得不够充分；相比TCA/丙酮法和酚抽法，TCA/丙酮+SDS酚抽法所获得的蛋白图谱，蛋白分离较为均匀，蛋白斑点多较圆且较清晰，综合考虑TCA/丙酮+SDS酚抽法更适合油茶种仁蛋白的提取。本试验中酚抽法蛋白提取所获得的凝胶在扫描图像时因操作不当导致凝胶图谱整体模糊；3块凝胶垂直方向上都有一条空白带，初步认为是由于胶条在平衡结束后，转移到SDS-PAGE凝胶时胶面贴合不够好造成的。

2.2 不同等电聚焦程序对比

聚焦时间的长短对于双向电泳的影响显著(图 2)。当聚焦伏小时数设定为60 000 V · h，聚焦时间不足，在双向电泳图谱上表现为整体横条纹明显，且蛋白点较为模糊。当聚焦伏小时数设定为62 000 V · h，在增加聚焦时间后，整体横条纹明显减少，且点较为清晰。因此，判断62 000 V · h的聚焦设定更适合油茶种仁蛋白的分离。

2.3 不同SDS凝胶浓度对比

参考油茶雌蕊的凝胶浓度设置^[20]，选取8%和10%的凝胶浓度进行双向电泳试验。不同浓度凝胶对蛋白在凝胶纵向上的分离有极大的影响(图 3)。8%凝胶浓度的双向电泳图谱蛋白斑点整体偏下分布，凝胶上半部蛋白点较少，可能与8%的凝胶空隙过大有关，高分子量区域的油茶种仁蛋白无法附着在空隙上。10%凝胶浓度凝胶的双向电泳图谱蛋白点纵向整体分布较均匀，蛋白斑点也较为清晰。因此，判断10%凝胶浓度适合油茶种仁蛋白第二向分离。

2.4 体系优化结果

图 4为体系优化结果图，根据上述各个单因素优化的试验结果，综合各项最优单因素对油茶种仁蛋白进行电泳试验，如图所示:采用TCA/丙酮+SDS酚抽法提取油茶种仁蛋白能够得到更多较为清晰的蛋白点，等电聚焦程序设置62 000 V · h的高压能有效的对油茶种仁蛋白进行分离；10%SDS凝胶浓度使得大部分油茶种仁蛋白质均匀分布在凝胶上。油茶种仁蛋白双向电泳影响因素较多，通过优化体系，分离得到的蛋白质可用于后期鉴定、利用等研究，对开展蛋白质组学相关研究具有重要意义。

3 讨论与结论

双向电泳是通过第一向固相IPG等电聚焦实现对不同等电点的蛋白质进行分离，在这基础上通过SDS-PAGE实现对不同分子量大小的蛋白质进行分离，最终实现不同蛋白质的二维分离^[21]。双向电泳图谱水平方向上不同的蛋白点拥有不同的等电点，垂直方向上不同的蛋白点则反映相应的分子量大小。样品制备的目的是去除蛋白以外的杂质，并且尽可能保留蛋白质。蛋白提取步骤越简单，蛋白丢失的可能性越小。不同的植物组织，细胞内部的次生物质、酶类等各不同^[22]，植物组织中蛋白质含量相对较低，蛋白复合物的存在导致不易分离，有些次生代谢产物也会与蛋白质结合，破坏蛋白质的结构，形成不可逆的复合物而干扰后续蛋白的分离和鉴定。因此，针对不同的植物材料，样品的提取优化尤为重要。本试验将TCA/丙酮+SDS酚抽法所制得的蛋白干粉溶解于SDS蛋白提取液，经甲醇醋酸铵沉淀的蛋白分离较为均匀，能够保持较多蛋白，橄榄叶片蛋白的提取应用此法也获得较好的效果^[23]。

固相pH等电聚焦IEF利用蛋白质等电点的不同在IPG胶条所构成的连续的、线性的、稳定的pH梯度中进行蛋白分离，对于等电点及分子量相近的蛋白质能够有很好的分离效果^[24]。一向等电聚焦刚开始时电流较低，电压慢慢上升直到升至预定聚焦电压，这个过程包括一系列电压梯度设定。不同的蛋白样品，需要设定不同的聚焦电压梯度。通常聚焦时间过短容易产生蛋白图谱整体水平和垂直条纹；聚焦时间过长则会导致蛋白质的迁移，并且容易出现水的电内渗，在双向电泳图谱上表现为胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白的丢失^[25]，本试验通过调整聚焦时间，发现当聚焦伏小时为62 000 V · h时，油茶种仁蛋白分离效果较好。

不同SDS凝胶浓度反映凝胶孔隙的大小，凝胶浓度越低，孔隙越大^[26]，表现为蛋白图谱中高分子量蛋白减少，蛋白点分布在双向电泳图谱的中下部。本试验通过参考油茶雌蕊蛋白凝胶浓度的选择，对比8%与10%的SDS-PAGE凝胶浓度对油茶种仁蛋白分离的不同，结果表明10%凝胶浓度更适合油茶种仁蛋白的提取。

试验结果表明不同的蛋白提取方法、聚焦时间以及凝胶浓度对双向电泳均产生影响。从体系优化图 4可以得知，TCA/丙酮+SDS酚抽法适合油茶种仁蛋白提取、62 000 Vh的聚焦程序设定和10%SDS凝胶浓度适合油茶种仁蛋白的分离。本研究建立了一套适合油茶种仁蛋白双向电泳分离的体系，为深入开展油茶蛋白质组学研究提供参考。