植物组织培养和植株再生体系的建立是基因工程育种的重要工作^[1]。通过组织培养建立高效植株再生体系主要有两种主要途径：器官发生途径和体细胞胚胎发生途径。其中器官发生分为直接器官发生和间接器官发生，植物的间接器官发生与体细胞胚胎发生都需要愈伤组织为材料，通过愈伤组织的进一步分化形成再生植株。因此获得大量的愈伤组织是植物体细胞胚胎发生的基础。而愈伤组织的继代培养是愈伤组织大量繁殖与再分化成功与否的关键。

杉木[Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook.]是我国南方主要造林与用材树种，早在20世纪80年代我国已开始通过组织培养方式进行快速繁殖杉木优良基因型树种，但研究仍停留在外植体不定芽的诱导研究上^[2-6]。直到21世纪初才出现有关杉木愈伤组织诱导的研究报道^[7-9]，但通过杉木愈伤组织成功建立植株再生的研究报道较少。而目前关于杉木愈伤组织的继代增殖与植株再生体系方面的研究还未多见。本研究以杉木子叶、下胚轴诱导的愈伤组织为材料，研究了植物激素组合、浓度及培养条件对愈伤组织的继代增殖和继代培养次数、激素浓度对植株再生的影响，以期为杉木通过愈伤组织途径建立高效植株再生体系提供依据，并为杉木遗传转化研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

材料来源于福建省漳平五一国有林场(北纬25°02′，东经117°29′)的杉木1.5代种子园中的种子，将种子培养于人工培养箱，取发芽15 d的实生苗子叶与下胚轴在MS+6-BA 2.0 mg·L^-1+NAA 2.0 mg·L^-1+TDZ 0.01 mg·L^-1进行愈伤组织诱导。以诱导的愈伤组织进行继代培养和再分化培养。

1.2 方法 1.2.1 愈伤组织继代培养基

将愈伤组织切成11 mm×11 mm块状，转接至不同培养基中，每15 d通过记录愈伤组织的鲜质量、直径增长量、褐化率，筛选出最佳的继代培养基。每种培养基接种20个，每个试验重复3次。以DCR(Gupta和Durzan, 1985)为基本培养基，其中, 蔗糖25 g·L^-1，琼脂7.0 g·L^-1，下同。具体培养基中的植物激素种类和浓度见表 1。

1.2.2 不同光照条件处理

将愈伤组织接种于0(暗培养)、800、1 000、1 200 lx四种光照条件下培养。其中，暗培养为全天培养，光照培养为12 h·d^-1, 温度23~27 ℃，相对湿度为65%~70%之间。

1.2.3 愈伤组织再分化培养基

将继代次数不同的愈伤组织接种在含有不同激素浓度的再分化培养基，在1 000 lx光照条件下进行培养，光照培养为12 h·d^-1, 温度23~27 ℃，相对湿度为65%~70%。以MS为基本培养基，具体培养基设计见表 2。

1.2.4 不定根诱导培养基

将愈伤组织再分化出的不定芽从愈伤组织上切离，分别转入含有0.2、0.6、1.0 mg·L^-1的IBA不定根诱导培养基，在1 000 lx光照条件下进行培养，光照培养为12 h·d^-1, 温度23~27 ℃，相对湿度为65%~70%之间。以1/2MS为基本培养基，活性炭0.3 g·L^-1。

1.2.5 数据统计方法

愈伤组织增重量、直径增长量、褐化率均每15 d记录一次，60 d为一个继代周期。其中愈伤组织的质量用电子秤测量，直径用电子游标卡尺计量。采用Excel 2003进行数据处理，运用SPSS18.0对试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVE)和邓肯多重比较(LSD)。具体计算公式为：

$ 愈伤组织增重量/{\rm g}=愈伤组织继代60~{\rm d}的质量-继代初的质量 $

(1)

$ 愈伤组织直径增长量/{\rm mm}=愈伤组织继代60~{\rm d}的直径-继代初的直径 $

(2)

$ 愈伤组织褐化率/\%=愈伤组织继代60~{\rm d}的褐化数/继代的个数×100 $

(3)

2 结果与分析 2.1 不同激素组合和浓度对愈伤组织继代增殖的影响

将愈伤组织接种在含有不同激素浓度的培养基中进行愈伤组织继代增殖。研究结果发现，不同激素处理对愈伤组织的直径增长量、质量增长量、褐化率均有显著差异(表 3)。其中，愈伤组织直径在处理4(6-BA 2.0 mg·L^-1+KT 1.5 mg·L^-1+NAA 1.5 mg·L^-1)中增长量最大，直径增长量为10.47 mm。愈伤组织质量在处理8(2，4-D 1.0 mg·L^-1+6-BA 2.0 mg·L^-1+KT 1.0 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1)中增量最大，质量增长量为1.7 g。愈伤组织褐化率在处理12(2，4-D 2.0 mg·L^-1+6-BA 2.0 mg·L^-1+KT 0.5 mg·L^-1)中最低，褐化率为11.46%。在试验过程中还发现在含有2，4-D的培养基中愈伤组织的褐化率有显著降低。NAA、KT对愈伤组织的直径、质量有显著增长，其中愈伤组织在含有NAA的培养基中质量增长量大于不含NAA的培养基；愈伤组织的直径增长量在含有KT培养基中大于不含KT的培养基。愈伤组织能否长期继代增殖的一项重要指标是褐化率，低频率的褐化现象可延长愈伤组织的继代增殖时间。愈伤组织的直径增长量是衡量一个愈伤组织是否有进行增殖的主要指标，愈伤组织是否处于活性无限扩增的直观表现是直径的变化。结合愈伤组织的继代增殖目的，研究表明：处理4和处理3(6-BA 1.5 mg·L^-1+KT 1.0 mg·L^-1+NAA 1.0 mg·L^-1)是愈伤组织继代增殖最佳培养基。

研究过程中还发现，愈伤组织在继代增殖过程中会出现3种不同增殖方式。一种是呈现细胞悬浮状扩增即愈伤组织会呈现贴壁依赖性增殖(图 5a)；一种是愈伤组织在增殖过程会出现新愈伤呈现活性增长但原有的愈伤组织会逐渐褐化凋亡(图 5b)；一种是新旧愈伤组织的活性呈现一致状态(图 5c)。

2.2 不同光照条件对愈伤组织继代增殖的影响

将愈伤组织放在4种不同光照强度条件下进行培养。研究结果发现(表 4)，光照强度对愈伤组织的直径增长量和质量增长量无显著差异，但对愈伤组织的褐化率存在显著差异。愈伤组织的褐化率随着光照强度的提升而逐渐提升。虽然光照强度对愈伤组织的直径增长量和质量增长量无显著差异，但研究表明，愈伤组织的直径增长量在暗培养和800 lx条件下较大，分别为8.32和8.56 mm；愈伤组织的质量增长量在有光照条件下较大，其中在1 200 lx光照强度下，愈伤组织的质量增长量达1.2 g；综合愈伤组织的直径增长量、质量增长量及褐化率3项指标，可见暗培养和低强度的光照培养均有利于愈伤组织的继代增殖。

2.3 不同培养条件对愈伤组织增殖变化的影响

将愈伤组织接种至继代效果较好的前6种培养基(正交试验中的处理1、处理3、处理4、处理7、处理11、处理13)进行周期变化观察，每隔15d进行测量统计。试验结果如图 1、图 2、图 3所示。6种处理下的愈伤组织直径增长量均随着时间的增长而增长，在4个时间段内的增长速度呈现先上升后下降趋势，但愈伤组织在最终阶段(45~60 d)的增长量仍均大于最初阶段(0~15 d)的增长量，其中在继代30~45 d期间增殖量最高。愈伤组织的质量增长量随继代时间的变化呈现先增后降的趋势，并且几乎均在30~45 d时间段内变化最大。愈伤组织的褐化率均随着继代时间的增加而呈线性上升，其中愈伤组织在继代的前15 d内均无褐化现象，褐化率均为0。根据愈伤组织的直径增长量、质量增长量、褐化率的变化趋势可得，愈伤组织在继代30~45 d期间内即可转移至新的培养基。

2.4 不同激素组合对愈伤组织再分化的影响

将子叶、下胚轴诱导的愈伤组织接种于不同激素浓度的MS培养基上，接种7 d后愈伤组织在处理2(6-BA 0.5 mg·L^-1 +KT 1.5 mg·L^-1)培养基上出现不同程度绿色细胞团，15 d后出现肉眼可见的再生芽点，25 d后可见再生芽凸出愈伤组织。40 d后统计不同激素处理下愈伤组织再生芽分化情况，结果见表 5：愈伤组织在处理3中分化率最高，其次是处理2(6-BA 0.5 mg·L^-1 +KT 1.0 mg·L^-1)和处理1(无激素)次之。再分化率分别为80%，60%，50%。试验过程中还发现：在无激素培养基上诱导的再生芽在培养一段时间后会出现营养不良现象(如失绿)，其次由愈伤组织诱导的再生芽会出现向光性(不定芽会向光弯曲)和极性现象(在不定芽顶端会再发生不定芽分裂)

2.5 不同继代次数对愈伤组织再分化的影响

将子叶、下胚轴诱导的愈伤组织通过无继代、继代后转移至再分化培养基中进行不定芽分化。研究结果如图 4所示：愈伤组织的继代次数对愈伤组织的再生芽分化率的抑制作用较为明显。愈伤组织的再生芽分化率随着愈伤组织的继代次数增加而不断下降，愈伤组织的褐化率则呈现上升趋势。其中，愈伤组织在无继代(诱导的愈伤组织直接接种于再分化培养基)时，再生芽分化率最高(83.57%)，褐化率10.07%；愈伤组织在继代1次后的再生芽分化率第二(82.37%), 褐化率16.70%。愈伤组织没有经过继代直接进行再分化，分化率虽然很高，但是每个愈伤组织只能再分化出一个不定芽(图 5d)，但经过继代的单个愈伤组织平均能都诱导出2~3个不定芽(图 5e)。试验过程中还发现，愈伤组织在再分化过程中会出现两种情况，一种是先诱导出不定根，后者很难再出现不定芽(图 5f)；另一种是先形成不定芽再诱导出不定根(图 5g)。根据试验现象可得，愈伤组织经过一次继代增殖最有利于再分化。

2.6 IBA对再生芽不定根的影响

将愈伤组织分化的不定芽从愈伤组织上切离，转入含有不同浓度的IBA培养基中进行不定根诱导，研究结果如表 6所示：不同浓度的IBA均能使再生苗生根。再生苗随着IBA浓度的增加其生根率逐渐提高且根系状况也逐渐提高。当IBA浓度为1.0 mg·L^-1时，再生苗生根率高达85.9%，此时根系的根长、质量均适合后期的移栽(图 5h、i)。试验过程中还发现，当出现不定根时，再生苗整体生长质量比无根时期好(如苗更绿、苗茎更粗)

3 讨论 3.1 培养基与愈伤组织继代、再分化

在针叶树的组织培养基中，愈伤组织的继代、再分化都与细胞分裂素、生长素的诱导有密切的关系。在杉木愈伤组织的继代过程中发现，2，4-D对愈伤组织的增殖无明显影响，但愈伤组织在含有2，4-D的培养基中褐化现象显著减少。张梅兰等^[10]在研究激素对黑松愈伤组织褐变和作用中也发现：在黑松愈伤组织形成以后加入低浓度的2, 4-D(0.5~2.5 mg·L^-1)能普遍减轻愈伤组织在继代培养中的褐变程度, 当2, 4-D的用量为1.0 mg·L^-1时, 褐变率为0。本研究还发现：杉木愈伤组织的继代只有在含有NAA、6-BA、KT培养基中其直径、质量均显著增殖，其中NAA起主导作用。这与刘宝光等^[11]在红皮云杉胚性愈伤组织保持与增殖阶段筛选的影响因子一样。但也有研究表明，长白松、刚松、南洋杉的愈伤组织在无外源激素调节下可获得很好继代效果^[12-14]。本研究中杉木愈伤组织再分化阶段与增殖阶段使用的细胞分裂素相同，但6-BA的浓度有所下降，当KT浓度是6-BA的3倍时，再分化率最高，说明在愈伤组织再分化过程中KT的细胞分裂能力比6-BA强。但杨模华等^[15]在马尾松嫩茎愈伤组织保持、增殖及不定芽分化培养中发现，当KT浓度是TDZ的两倍时，可分化出不定芽，并进一步证明TDZ对马尾松愈伤组织的器官分化有效。

3.2 培养条件与愈伤组织继代、再分化

组织培养的温度、湿度、光照时数、光照强度等均会在一定程度上影响愈伤组织的继代与再分化。不同的植物、不同的培养阶段其培养环境有所不同。在杉木愈伤组织继代过程中发现，适当的提高光照强度(800 lx)有利于愈伤组织的增殖，但过高的光照会加重愈伤组织的褐化现象。在柏科植物的愈伤组织增殖过程中一般采用暗培养，如CASTRO et al^[16]在欧洲刺柏体细胞胚培养中，愈伤组织在完全黑暗条件下进行继代培养，最终获得胚性细胞系。杉木的愈伤组织再分化及不定根诱导过程中均需要较强的光照条件培养，这与许多研究者在不同外植体愈伤组织诱导与植株再生研究中发现一致^[17-18]。但刺柏在生根培养时需先进行7 d暗培养才可提高生根率^[19]。

4 结论

杉木愈伤组织能进行大量增殖并成功进行再生芽分化，这可为杉木体细胞杂交和遗传转化等基因工程研究需求的高效受体系统提供技术支撑。其中愈伤组织在无继代条件下能够再生芽分化，表明愈伤组织本身存在再生芽分化所需的内源激素和营养物质。