森林与环境学报  2018, Vol. 38 Issue (1): 1-6   PDF    
http://dx.doi.org/10.13324/j.cnki.jfcf.2018.01.001
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陈潇潇, 曹光球, 汪凤林, 罗红艳, 魏晓骁, 曹世江
CHEN Xiaoxiao, CAO Guangqiu, WANG Fenglin, LUO Hongyan, WEI Xiaoxiao, CAO Shijiang
杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因的克隆与表达分析
Cloning and expression analysis of cellulose synthase ClCesA2 from Cunninghamia lanceolata
森林与环境学报,2018, 38(1): 1-6.
Journal of Forest and Environment,2018, 38(1): 1-6.
http://dx.doi.org/10.13324/j.cnki.jfcf.2018.01.001

文章历史

收稿日期: 2017-04-14
修回日期: 2017-05-25
杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因的克隆与表达分析
陈潇潇1,2, 曹光球1,2, 汪凤林1,2, 罗红艳1,2, 魏晓骁1,2, 曹世江1,2     
1. 福建农林大学林学院, 福建 福州 350002;
2. 国家林业局杉木工程技术研究中心, 福建 福州 350002
摘要:为探索杉木木材发育的分子机制,以杉木幼苗嫩叶总RNA为模板,利用反转录获得的cDNA进行聚合酶链式反应(PCR),获得杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因。对该基因进行测序以及序列分析表明,该基因开放阅读框全长3 276 bp,共编码1 091个氨基酸,具有锌指结构和8个跨膜区域,及保守的DX……QVLRW结构域。荧光定量PCR结果表明,该基因在杉木的根、茎、叶中相对表达量有明显差异,茎的相对表达量最高,根次之,叶最低。系统进化树分析表明该基因与初生壁合成相关基因聚在一起,推测该基因可能参与杉木细胞初生壁的形成。
关键词杉木    纤维素合酶基因    克隆    序列分析    
Cloning and expression analysis of cellulose synthase ClCesA2 from Cunninghamia lanceolata
CHEN Xiaoxiao1,2, CAO Guangqiu1,2, WANG Fenglin1,2, LUO Hongyan1,2, WEI Xiaoxiao1,2, CAO Shijiang1,2     
1. College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China;
2. Chinese Fir Engineering Technology Research Center under State Forestry Administration, Fuzhou, Fujian 350002, China
Abstract: In order to explore the mechanism of wood development of Chinese fir, total RNA extracted from Chinese fir seedlings was used for RT-PCR, then the full-length open reading frame sequence of ClCesA2 gene was amplified.Sequencing and analysis of the gene showed that the full length was 3 276 bp, encoding 1 091 amino acids, containing zinc finger structure, eight cross membranes and a conservative DX……QVLRW structure domain.The qPCR result revealed that the gene highly expressed in the stem, followed by root and leaf.Phylogenetic tree analysis showed that the gene was clustered with genes involved in the synthesis of the primary wall which inferred that the ClCesA2 gene may play an important role in the process of cellulose synthesis of the primary cell wall.
Key words: Cunninghamia lanceolata (Lamb.)Hook.     cellulose synthase gene     cloning     sequence analysis    

纤维素是地球上重要的可再生资源,是植物细胞壁重要的骨架结构之一,是由D-葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的一种线性葡聚糖[1],在造纸、纺织、林业等诸多领域中有广泛的经济价值。高等植物纤维细胞发育过程复杂,受多种基因调控,纤维素合酶(CesA)是纤维形成的关键酶之一,主要催化纤维素的合成[2-5]。目前,已从40多种植物中克隆到1 400多个CesA基因的相关序列,在拟南芥[Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.]中鉴定出10个CesA基因,毛果杨(Populus trichocarpa)中鉴定出18个CesA基因[6],绿竹[Dendrocalamopsis oldhami (Munro) Keng f.]中鉴定出8个CesA基因[7]。其中拟南芥的AtCesA1、AtCesA3、AtCesA6基因主要参与初生细胞壁合成,AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8基因主要参与次生细胞壁合成[8-10]。在毛果杨中,PtCesA4、PtCesA7、PtCesA8、PtCesA17、PtCesA18基因构成了纤维素合酶复合体Ⅰ,主要参与细胞次生壁的合成,复合体Ⅱ由PtCesA3、PtCesA10、PtCesA11、PtCesA13、PtCesA15、PtCesA16基因构成,参与初生细胞壁和次生细胞壁的合成[11-13]

杉木[Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook.]是我国南方重要的造林树种,也是我国主要的用材林树种[14]。然而,我国杉木人工林的木质不紧密,易开裂和变形,在轮伐期短的林分中表现得尤为突出,极大程度地限制了杉木木材的用途。目前,国内学者开展一系列有关杉木木材细胞壁化学成分的研究,均是从化学的角度来探究细胞壁与其木材性质之间的关系,但对于遗传操作改良杉木的木材品质这一方法尚未涉及[15-17]。本课题组前期已从杉木中克隆出杉木纤维素合酶(ClCesA1)基因,并对该基因的结构以及功能做出了预测[18]。因此,对杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因结构、功能以及其在不同组织中表达情况的研究和了解,对杉木材质的遗传改良具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 材料

试验材料为1年生杉木无性系061幼苗,由国家林业局杉木工程技术研究中心实验室提供。

1.2 杉木总RNA提取与cDNA合成

总RNA的提取采用天根植物多糖多酚总RNA试剂盒进行;cDNA第1链的合成采用TIANScript cDNA第1链合成试剂盒进行。

1.3 ClCesA2基因的扩增与实时荧光定量聚合酶链式反应

利用NCBI上的GenBank数据库已知的杉木DNA序列,设计特异引物及实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)引物,并递交上海生物工程技术有限公司合成,引物设计见表 1。PCR扩增反应条件如下(采用20 μL体系):cDNA 2 μL,引物ClCesA2-Fw(10 μM)1 μL,引物ClCesA2-Rv(10 μM)1 μL,10×KOD Buffer 2 μL,dNTP Mixture(2.5 mM)4 μL,DNA Polymerase KOD(2.5 U·μL-1)0.2 μL,ddH2O加至20 μL。95 ℃预变性3 min,94 ℃变性1 min,53 ℃退火3 min,72 ℃延伸3 min,共30个循环,最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。扩增后产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。利用实时荧光定量PCR仪器(LightCycler® Nano,Roche,瑞士)研究ClCesA2基因在不同组织的表达,qPCR扩增试剂为TransStart® Tip Green qPCR SuperMix,采用荧光染料为SYBR GreenⅠ,杉木EF1α基因作为内参基因。

表 1 引物设计 Table 1 Primer design
引物名称
Primer name
引物序列(5′-3′)
Primer sequence
ClCesA2-Fw ATGGAGGCCAACGCTGGC
ClCesA2-Rv TCAGCAATTGACACCACATTGTTGTG
CesA2 Q Fw GTCGCAGGATCTCATAACAGG
CesA2Q Rv CACATTCATTGCAGGCTACA
EF1α-Fw CAAAGAAGGGTGCCAATGA
EF1α-Rv ACCAAACAACCGACCTACGA
1.4 ClCesA2基因序列的生物信息学分析

将PCR产物送至上海生物工程技术有限公司进行测序。测序结果用Vector NTI翻译成氨基酸序列在BLAST进行同源性比对,并使用MEGA6中Neighbor-Joining法构建系统进化树。用ProtParam tool在线软件预测ClCesA2蛋白的理化性质,ProtScale软件分析ClCesA2蛋白的疏水性,ProtFun分析预测ClCesA2蛋白的功能。用Scratch Protein Predictor软件对蛋白质序列进行2级结构预测,利用TMHMM软件进行蛋白质跨膜区预测。

2 结果与分析 2.1 总RNA质量检测

提取的杉木叶片总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测(图 1),18 S和28 S条带完整且清晰,28 S的亮度约为18 S的2倍,无拖尾现象,无DNA污染。超微量分光光度计检测A260/A280=1.91,说明其质量满足反转录及后续试验需求。

图 1 总RNA电泳图 Fig. 1 Electrophoretogram of total RNA
2.2 ClCesA2基因克隆

以061杉木叶片提取的RNA反转录得到的cDNA为模板,通过设计的特异性引物进行PCR扩增,产物经1%琼脂糖凝胶电泳,得到长度约为3 200 bp的条带(图 2),目的片段进行测序后获得了长度为3 276 bp的序列, 经验证无误。

图 2 ClCesA2基因PCR扩增产物 Fig. 2 PCR amplification product of ClCesA2 gene
2.3 生物信息学分析 2.3.1 ClCesA2蛋白同源比对与进化树的构建

在Pfam上对其机构域进行分析,在32~97氨基酸位点具有锌指结构CXXC(半胱氨酸氨-xx-半胱氨酸氨)。在787~890氨基酸位点具有保守的天冬氨酸残基,为糖基转移酶家族结构域Glyco-tranf-2-3(图 3),利用NCBI CDD在线工具对其鉴定在524~842氨基酸位点含有CesA-CelA-like结构域,因此该蛋白被确认为杉木CesA/Csl家族蛋白。运用MEGA 6构建分子进化树,将克隆到的基因翻译成的蛋白序列与拟南芥,水稻(Oryza sativa L.),颤杨(Populus tremuloides),欧美杂种山杨(Populus tremula L.×Populus tremuloides),毛白杨(Populus tomentosa Carr.),火炬松(Pinus taeda Linn.)的细胞CesA基因进行系统树分析。ClCesA2基因与细胞初生壁合成有关的基因AtCesA1,PtrCesA4聚在一起(图 4),推测ClCesA2基因可能与杉木细胞初生壁合成有关。

图 3 ClCesA2蛋白序列 Fig. 3 Protein sequence of ClCesA2 注:图中黄色区域为锌指结构;红色区域为跨膜结构区;红字区域为纤维素合酶底物结合结构。 Note: the yellow region indicates ring finger dimain, the red regin indicates transmembrane domain and the red words region indicates cellulose synthase substrate binding structure.
图 4 ClCesA2基因系统进化树 Fig. 4 Phylogenetic tree of ClCesA2 gene 注:分支上的数值表示Bootstrap验证中基于1 000次检验重复该节点的可信度。 Note: number on the branches represent the reliability percent of bootstrap test based on 1 000 replications.
2.3.2 ClCesA2蛋白的基本性质

Protparam预测ClCesA2蛋白的理化性质,推测该蛋白相对分子质量为122 820.41 Da,等电点PI为6.65,理论推导半衰期为30 h,Leu含量最高,达8.6%,其次为Gly, 占7.5%,不稳定系数为39.21,属于稳定蛋白。经ProtScale软件分析可知, ClCesA2蛋白的疏水性最高, 分值为3.278,亲水性最高分为-3.544,整体而言,ClCesA2蛋白的整条多肽链亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸,由此推测该蛋白属于亲水性蛋白(图 5)。利用ProtFun分析预测ClCesA2蛋白的功能,表明该蛋白具有生物合成相关的电压门控离子通道连接酶的作用。

图 5 ClCesA2蛋白氨基酸序列的疏水性分析 Fig. 5 The hydrophobicity analysis of sequence of protein amino acid of ClCesA2
2.3.3 ClCesA2蛋白的结构特点

用PBIL LYON-GERLAND信息库对蛋白质序列进行2级结构预测,表明ClCesA2蛋白的2级结构中α-螺旋占98.81%,β-折叠占0.88%,无规则卷曲占0.31%,预计可形成二硫键13个,分别在1 087~1 091、590~602、403~432、39~42、770~809、81~84、882~888、647~648、670~676、61~69、58~66、575~674、675~847氨基酸位点,参与维持蛋白质构象的稳定。利用TMHMM软件进行蛋白质跨膜区预测,跨膜结构预测表明ClCesA2蛋白有8个跨膜区,分别是285~307、314~333、868~890、902~924、939~961、982~1 004、1 019~1 041、1 054~1 073氨基酸位点(图 6),最大跨膜区域为22个氨基酸残基,最小跨膜区域为19个氨基酸残基,平均跨膜区域为21个氨基酸残基。

图 6 ClCesA2蛋白氨基酸序列的跨膜区预测 Fig. 6 Prediction of trasmembrane domains of protein amino acid of ClCesA2
2.4 ClCesA2基因的表达分析

在杉木根、茎、叶3种组织中, ClCesA2基因均有表达,表达量有显著差异(图 7)。其中,在茎中的表达量最高,大约为叶的20倍,根的表达量约为叶的10倍,叶的表达量最低。并且ClCesA2基因在杉木茎中的表达量较高,提示其在杉木韧皮纤维的合成过程中可能具有重要作用。

图 7 不同组织中ClCesA2基因相对表达量 Fig. 7 Relative expression of ClCesA2 gene in different tissues
3 讨论

除植物外,一些细菌也可以合成纤维素。CesA基因最初的就是从醋酸杆菌中分离的[19-20]。随后先后从棉花、拟南芥、杨树等植物中克隆到了CesA基因,并进行了一系列的功能预测与验证。有关拟南芥中发现的10个CesA基因,已经先后从生化和遗传的角度证明了其在细胞壁合成中的功能。在欧洲颤杨中有证据表明ptrCesA6与茎的伸长生长有关,在杨树枝条生长的快速阶段表达量高[21]。水稻中也先后发现了12个CesA基因,有关CesA基因在水稻中功能的研究不仅限于纤维素合成的作用。水稻中的OsCesA4基因的过量表达会降低植株在幼苗期耐旱、耐高温、耐高盐性,对水稻的结实率也有一定影响[22]。但林木生物技术相对发展较慢,有关ClCesA基因在杉木中的其他方面的功能有待进一步研究与证实。

本课题组已发表一篇有关ClCesA1基因的文章[18]ClCesA1基因先于本研究的ClCesA2基因克隆出来,且这两个基因均来自于杉木。生物信息学分析结果对比表明,ClCesA1基因的开放阅读框为2 955 bp,共编码984个氨基酸,ClCesA2基因开放阅读框全长3 276 bp,共编码1 091个氨基酸。ClCesA1基因和ClCesA2基因氨基酸相似性为62.4%,都有8个跨膜区域,最大跨膜区域同为22个氨基酸残基,但ClCesA2最小跨膜区域为19个氨基酸残基,ClCesA1基因最小跨膜区域为12个氨基酸残基。相对表达量分析结果对比显示,ClCesA1基因在根中表达量最高,ClCesA2基因在茎中表达量最高。根据系统进化树分析研究,该基因在功能上的预测与ClCesA1基因有所不同,ClCesA2基因可能参与杉木细胞初生壁的形成,而ClCesA1基因可能参与杉木细胞次生壁的形成。本课题组目前虽然已从杉木中克隆到两个CesA基因,但本课题组有关杉木的基因组的测序未完成,尚且不能确定杉木中是否还存在CesA家族的其他基因。

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