锥栗[Castanea henryi (Skam) Rehd. et Wils.]是壳斗科(Fagaceae)栗属(Castanea)树种，属落叶乔木，是一次栽培百年收益的木本坚果^[1]，在我国主要分布于长江流域以南，是南方著名的木本粮食和果材兼用树种。福建作为锥栗的重要主产区之一，具有丰富的遗传资源以及悠久的栽培历史，由于随机混合种植的传统栽培方式，促进了个体之间的基因交流，形成了一批广为栽培的农家品种^[2]。

分子标记技术近年来发展迅速，因其能避免环境影响，可在脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)水平上直接反映个体或种群间的遗传多样性^[3]。ABDELHAMID et al^[4]运用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、简单重复序列间区(inter-simple sequence repeat，ISSR)和简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)4种分子标记技术研究了板栗的遗传多样性，INOUE et al^[5]选用了7对日本栗的SSR引物组合对50个来自朝鲜、中国、日本的栗属品种进行了亲缘关系鉴定。目前，运用分子标记技术对锥栗的研究已有RAPD^[6]、ISSR^[7]等方面的报道，但以上2种标记存在重复性不高、操作复杂、成本高的不足之处。相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)已被广泛用于多种植物遗传多样性的研究中^[8-10]，但在锥栗的研究中应用较少。文中以福建省建瓯市17个锥栗主栽农家品种为材料，通过SRAP分子标记技术分析品种间遗传多样性并构建DNA指纹图谱，为锥栗杂交育种和遗传作图的亲本选配提供参考。

研究所选材料为福建省建瓯市水源乡主栽的17个锥栗主栽农家品种，其均为2000年9月以野生毛榛为砧木嫁接而来，品种名称分别为处暑红(CSH)、双峰子(SFZ)、大苞榛(DBZ)、乌榛(WZ)、大尖嘴(DJZ)、油榛(YZ)、中尖嘴(ZJZ)、黄榛(HZ)、铁锥(TZ)、油桐仔(YTZ)、小尖嘴(XJZ)、乌壳长芒(WKCM)、牛角仔(晚熟)(NJZWS)、牛角仔(中熟)(NJZZS)、红仔榛(HZZ)、欧宁仔(ONZ)和白露仔(BLZ)等。于2016年5月初采集树龄为15~17年生的健壮植株上无病虫害的嫩叶，快速放入装有硅胶的自封袋中吸水干燥，带回实验室常温保存。

采用试剂盒法(北京康为世纪)提取锥栗农家品种的基因组DNA，用NanoDrop ND-1000核酸蛋白检测仪(NanoDrop Technologies Inc.，美国)检测DNA的浓度，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。

从16×16共256对引物组合中筛选出10对具有丰富多态性的SRAP引物组合对17个锥栗农家品种进行扩增(表 1)。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)程序基本采用LI et al^[8]的方法，稍作改良。

采取人工读电泳图的方式，有清晰条带的记为“1”，无条带的记为“0”，将数据输入Excel中形成原始的二元矩阵，利用NTSYS 2. 1软件计算遗传相似系数以及以非加权组平均法进行聚类分析。对每对引物扩增的条带计算总扩增带数(total number of bands，TNB)、多态性带数(number of polymorphic bands，NPB)、多态性条带百分比(percentage of polymorphic bands，PPB)、多态性信息量(polymorphic information content，PIC)、条带信息指数(band informativeness index，BII)、条带分辨力(resolving power，RP)和标记指数(marker index，MI)等。其中P_PB=N_PB/N_TB，C_PI=∑C_{PI, i}/N_PB，I_BI=∑I_{BI, i}/N_PB，P_R=∑I_{BI, i}，I_M=∑C_{PI, i}，C_{PI, i}=2f_i (1－f_i)，I_{BI, i}=1-2×| 0. 5-f_i |，f_i为扩增带等位基因的频率，1-f_i为无效带等位基因频率。

利用从256对SRAP标记引物组合中筛选出的10对引物组合对17个锥栗主栽农家品种进行了扩增(图 1，图 2，表 2)，扩增片段大小主要集中在50~2 000 bp，10对引物组合共扩增出了200个条带，NPB有183个，占91.5%, 平均每对引物组合扩增出的条带数为20，平均扩增出的NPB为18.3。引物组合em6me8和em5me9的PPB为100%，引物组合em6me16的PPB最小，为78.6%。单个引物组合的PIC值变幅为0.230~0.378，平均值为0.311；引物组合的BII变幅为0.282~0.557，平均值为0.444；引物组合的RP变幅为2.822~12.822，平均值为8.472；MI的变幅为2.297~8.704，平均值为5.877。一般情况下，具有较高的RP和MI的引物组合同时具有较高的多态性，可以分辨更多的品种^[11]。

	图 1 引物em2me8扩增的电泳结果 Fig. 1 The electrophoresis result of primer of em2me8
图选项

	图 2 引物em5me9扩增的电泳结果 Fig. 2 The electrophoresis result of primer of em5me9
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从17个锥栗主栽农家品种的遗传相似系数(表 3)可知，遗传相似系数变化范围为0.508 2~0.797 8，变幅为0.289 6，平均为0.653 0，表明17个锥栗主栽农家品种间存在一定的遗传差异。其中，DJZ与ZJZ的遗传相似系数最大，说明其亲缘关系最近，遗传差异最小；DJZ与SFZ的遗传相似系数最小，说明其亲缘关系最远，遗传差异最大。

从聚类图(图 3)可知，在遗传相似系数为0.655 7时，17个锥栗主栽农家品种分为了3大类:第Ⅰ类包括3个农家品种，为CSH、SFZ和WKCM；第Ⅱ类包括11个农家品种，为DBZ、NJZWS、WZ、TZ、NJZZS、ONZ、HZZ、HZ、YTZ、BLZ和YZ；第Ⅲ类包括3个农家品种，为DJZ、ZJZ和XJZ。

	图 3 17个锥栗主栽农家品种的聚类图 Fig. 3 Dendrogram of 17 C. henryi cultivars
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分析10对引物组合的扩增结果，引物组合em2me8可以将17个锥栗主栽农家品种完全鉴别出来，并构建了锥栗农家品种的DNA指纹图谱(表 4)。

SRAP是由LI et al^[12]于2001年开发的无需任何序列信息即可直接进行PCR扩增的新型分子标记技术，具有标记结果稳定、易于扩增目标片段、高多态性及成本低等特点。大量研究表明，SRAP标记效率高于其他分子标记技术，可以将亲缘关系很近的品种鉴别出来^[13]。

文中从256对引物组合中筛选获得多态性较好的引物组合10对，这些引物组合PPB平均为91.1%，PIC值平均为0.311，说明SRAP分子标记引物可以较好地适用于锥栗的遗传多样性研究。引物组合em2me8构建了17个锥栗主栽农家品种的DNA指纹图谱，为农家品种的快速鉴别提供了参考依据。利用筛选出的10对引物组合对17个锥栗主栽农家品种进行SRAP标记分析，PPB平均为91.1%，高于向晖等^[14]的研究结果，PPB为89.14%，其原因可能为：文中筛选了大量的引物组合并从中选择了最优的组合；文中所选的农家品种具有较高的遗传多样性水平。在进行农家品种间的聚类分析时，遗传相似系数变幅为0.289 6，平均为0.653 0，表明17个锥栗主栽农家品种间存在一定的遗传变异。在遗传相似系数为0.655 7时，17个锥栗主栽农家品种分为了3大类:第Ⅰ类包括3个农家品种，为CSH、SFZ、WKCM；第Ⅱ类包括11个农家品种，为DBZ、NJZWS、WZ、TZ、NJZZS、ONZ、HZZ、HZ、YTZ、BLZ和YZ；第Ⅲ类包括3个农家品种，为DJZ、ZJZ和XJZ。这和雷日平等^[4]采用RAPD标记技术、刘国彬等^[5]采用ISSR技术、本课题组采用SSR标记技术(未发表)的聚类结果不尽相同，其可能有以下原因：用于聚类分析研究的材料来源不同；3种分子标记技术扩增的是基因组的不同区域；用于聚类分析的PIC不同。目前，多种植物的遗传多样性研究中联合使用了多种分子标记的技术^[15-17]，由于各种分子标记技术自身都存在一定的局限性，多种分子技术数据综合分析可以获得更准确的聚类分析和分子鉴定的结果。白玮玮等^[18]以建瓯市的15个锥栗主栽农家品种为材料，研究了生长与产量性状的遗传变异情况，通过综合评价得出，CSH、WZ、HZZ 3个农家品种表现优良，联合文中的农家品种间亲缘关系，可考虑作为优势杂交育种的亲本为CSH和WZ或CSH和HZZ。但是否选配为杂交育种和遗传作图群体的亲本，还要考虑农家品种的抗病性、成熟期早晚、果实品质等，这在今后需要进一步探讨与研究。