我国干旱、半干旱地区面积占国土总面积的45.0% 以上，干旱已成为我国乃至全球面临的最重要生态问题，也是限制植物生长和作物产量的最主要因子之一，随着地球变暖和降水模式的改变，情况将愈发严重^[1]。干旱会引起植物渗透胁迫，降低叶片水势导致吸水困难，进而对植物生长产生不利影响，如降低展叶率和叶面积，减少叶片生长速度，加速植物衰老等^[2]，相关研究已广泛开展^[3-6]。杨树(Populus)是我国主要的用材林和防护林树种，品种多，被广泛栽培，但在干旱、半干旱地区，由于灌溉条件的缺乏，杨树的生长受到严重抑制，降低了杨树的经济和生态效益^[7]。‘INRA 717-1B4’杂交杨(Populus tremula L. × P. alba L.，‘717’杂交杨)是从欧洲山杨和银白杨的杂交群体中选育出的优良品种，具有较强的耐逆性，对植被恢复、防止水土流失和盐碱地修复具有很大的应用价值，又可用于生物质能源和纤维能源开发^[8-9]。目前对‘717’杂交杨的抗逆性已经有了一些研究，如‘717’杂交杨在镉胁迫下净光合效率和生长受到抑制^[10]，转基因的‘717’杂交杨中Fe-SOD基因在干旱胁迫下，较野生型有较强的表达^[8]，但干旱胁迫对‘717’杂交杨的抗氧化性研究还尚未见报道。

近年来，组织培养技术以其经济、可控、节约空间和时间等优点已成为研究植物胁迫的重要手段，特别是对生长周期长的木本植物^[11], 该研究系统对木本植物早期抗性研究、快速发掘抗性基因具有重要价值。本研究以‘717'杂交杨组培苗为试验材料，采用不同浓度聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)6000对其进行模拟干旱胁迫处理。研究‘717'杂交杨对干旱胁迫的生理响应、抗氧能力及耐受性，为‘717'杂交杨对干旱胁迫响应、扩大栽培范围、提高生态防护功能、增加林农和企业的收益提供理论依据。

‘717'杂交杨无菌苗来自于南京林业大学组织培养室。

以‘717'杂交杨无菌苗2 cm带芽茎段为外植体，接种在1/2 MS+0.25 g·L^-1MES[2-(N-吗啉)乙磺酸]+0.2 g·L^-1 L-谷氨酸的分化培养基上进行茎段诱导，30 d左右长至5.0~6.0 cm；取2.0~3.0 cm的顶芽，接种在MS+0.2 mg·L^-1 BA+200 mg·L^-1泛酸钙+0.25 g·L^-1 MES+0.2 g·L^-1L-谷氨酸的生根培养基上进行培养，50 d后选取长势一致的组培苗进行处理。

以不加PEG的生根培养基为对照，以在生根培养基中添加2.5%、5.0%、10.0% PEG模拟干旱试验。每瓶接入1株组培苗，每处理20株苗。

培养基均添加3.0%蔗糖、0.65%琼脂，培养温度为(25±2) ℃，光照强度为55 μmol·m^-2·s^-1，光照时间为14 h·d^-1。分别培养10 d和20 d后，将苗取出，洗净培养基，取中部叶片称重后放入-70 ℃冰箱保存用于生理指标测定，对剪去叶片后的植株进行株高、主根长测定。

丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸比色法，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性测定采用抑制NBT光化还原法，过氧化氢酶(catalase，CAT)活性测定采用紫外吸收法，过氧化物酶(peroxidase，POD)活性测定采用愈创木酚法，抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)采用紫外吸收法，过氧化氢(H₂O₂)含量测定采用硫酸钛法，上述指标测定均参照赵世杰法^[12]；还原型抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)含量、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)含量、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)活性3指标测定参照陈建勋法^[13]。GR活性测定方法有所改良，样品用0.05 mmol·L^-1磷酸缓冲液(pH值7.0) 研磨提取，4 ℃ 8 000 r·min^-1下，离心15 min, 取上清液。2.5 mL的样品测定体系包括：1.0 mmol·L^-1NADPH，2.0 mL pH值为7.8的磷酸缓冲液、5.0 mmol·L^-1氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSH)和粗酶液，在紫外/可见分光光度计下测定340 nm处的光密度值。

试验3次重复，所得数据计算平均值和标准误，采用SPSS 17.0软件进行方差分析。

PEG处理对‘717'杂交杨组培苗的生长产生了一定的影响。PEG处理后，‘717'杂交杨的叶面积较对照减小，10.0%PEG处理的叶片出现了卷曲、干枯、变黄的症状，但仍可见腋芽长出。10 d时，主根长和茎长的增减趋势一致，都随PEG浓度上升呈先上升后下降的趋势。2.5%PEG处理时，茎长较对照显著增加了28.5%(P < 0.05) [图 1(a)]，主根长较对照增长了19.3%[图 1(b)]。说明2.5%PEG浓度可以促进‘717'杨的生长。与对照相比，5.0%和10.0%PEG处理20 d时‘717'杂交杨茎长和主根长较对照显著降低(P < 0.05)，10.0%PEG处理使得‘717'杂交杨的生长较对照降低，根长、茎长分别较对照减少25.3%和23.0%。

	图 1 不同浓度PEG处理对‘717'杂交杨植株生长的影响 Fig. 1 Effect of different PEG doses on plant growth of '717' hybrid poplar plantlet
图选项

PEG处理后，H₂O₂含量随着PEG浓度增加而增加，且均较对照显著增加(P＜0.05)，10.0%PEG处理10 d和20 d时，H₂O₂含量分别是对照的5.1和4.0倍[图 2(a)]。2.5%PEG处理10 d时，MDA含量出现轻微下降, 5.0%和10.0%PEG处理10 d时, MDA含量则较对照显著增加(P < 0.05)。处理20 d时，MDA含量随PEG浓度的增加而增加，10.0%PEG处理后，‘717'杂交杨MDA含量较对照显著增加了18.8%[图 2(b)]。

	图 2 不同浓度PEG处理对‘717'杂交杨H2O2和MDA含量的影响 Fig. 2 Effect of different PEG doses on H2O2 and MDA content of '717' hybrid poplar plantlet
图选项

不同浓度PEG处理下，‘717'杂交杨组培苗的5种抗氧化酶活性均有着不同的变化。PEG处理使得SOD活性呈现随着PEG浓度增大而减弱的趋势[图 3(a)]，10.0%PEG处理10 d和20 d时，SOD活性分别较对照降低26.6%，40.7%(P < 0.05)。干旱处理10 d，POD活性随着PEG浓度的增加而上升[图 3(b)]，分别较对照上升18.8%，20.5%和32.6%(P < 0.05)。处理20 d时，POD活性均较对照显著增加(P < 0.05)。CAT活性在PEG干旱处理后显著增加(P < 0.05)，2.5%PEG处理10 d时，CAT活性是对照的2.1倍[图 3(c)]。PEG处理20 d时，CAT活性较对照显著增强，10.0%PEG处理时较5.0%PEG处理下降，各处理较对照分别增加了37.7%，69.4%和60.9%。PEG干旱处理后，APX活性均呈上升趋势[图 3(d)]，各处理相较于对照显著增加(P < 0.05)，5.0%和10.0%PEG处理间不存在显著差异，10.0%PEG处理10 d和20 d时，APX活性分别是对照的1.8和1.5倍。2.5%PEG处理时，GR活性与对照没有明显差异(P>0.05)。5.0%和10.0%PEG处理20 d时，GR活性均较对照显著增加(P < 0.05)，其中5.0%PEG处理时活性强于其他处理，是对照的1.8倍[图 3(e)]。

	图 3 不同浓度PEG处理对‘717'杂交杨5种抗氧化酶活性的影响 Fig. 3 Effect of different PEG doses on the activity of five protective enzymes of '717' hybrid poplar plantlet
图选项

PEG干旱胁迫后，随着PEG浓度增大，AsA含量呈上升趋势。AsA含量在5.0%和10.0%PEG处理10 d时相比于对照显著增加(P < 0.05)，分别较对照增加73.5%和74.8%。干旱胁迫20 d时，各处理相较于对照都是显著增加(P < 0.05)，其中10.0%PEG处理时，AsA含量较对照增加了70.9%[图 4(a)]。PEG处理10 d时，2.5%PEG处理时GSH含量较对照显著增加(P < 0.05)，是对照的1.9倍。20 d干旱胁迫时，GSH含量显著增加(P < 0.05)，分别较对照增加了35.3%，46. 6%和44.7%[图 4(b)]。

	图 4 不同浓度PEG处理对‘717'杂交杨AsA和GSH含量的影响 Fig. 4 Effect of different PEG doses on AsA and GSH content in '717' hybrid poplar plantlet
图选项

在土壤或者培养基中，植物的根系是吸收水分最重要的器官，也是干旱胁迫最直接的影响部位^[14]。植物的地上部分高度也可以部分反应干旱对植物的影响。本研究中，2.5%PEG处理时，‘717'杂交杨茎长和根长均较对照显著增长，说明较低浓度的PEG(2.5%)处理可以促进‘717'杨的生长。而10.0%PEG使其根长和茎长较对照下降，说明已经对‘717'杂交杨产生了毒害作用，抑制其生长。

干旱胁迫也会引起氧化胁迫，造成活性氧(Reactive oxygen species, ROS)过量形成，主要有H₂O₂、·OH、O₂^·-等，这些活性氧的产生与清除如果无法达到平衡，超出植物自身清除活性氧的能力，就会对蛋白质、膜质、DNA等单分子物质造成严重损伤^[15]。活性氧也会使得细胞膜透性增加，有学者认为膜脂过氧化产物MDA含量的高低，可以作为抗旱指标^[16]。本研究中，H₂O₂含量在处理10 d和20 d时均随着PEG浓度增加而升高。‘717'杂交杨在PEG处理10 d时，MDA含量在较高浓度(5.0%和10.0%)PEG处理时较对照有了显著的增加，而在2.5%PEG处理时，MDA含量较对照轻微的减少。在PEG处理20 d时，MDA含量随着PEG浓度的增加而增加，这和对漾濞核桃幼苗在PEG模拟的干旱胁迫下的结果基本一致^[17]，说明干旱程度的加剧促进了H₂O₂合成，在较高浓度的PEG(5.0%和10.0%)处理较长时间(20 d)后，体内活性氧的产生和清除平衡被打破，膜脂过氧化作用加重。

ROS主要依靠SOD、POD、CAT、APX、GR等酶系统和抗氧化物质AsA、GSH、叶黄素、维生素E等组成的非酶系统来完成清除^[11]。有研究表明，干旱胁迫下SOD、POD和CAT活性增强，能加快活性氧的清除，可以维持活性氧代谢平衡、保护膜结构^[18-19]。本次研究中，‘717'杂交杨SOD活性随着干旱胁迫加深而下降，‘南林895'杨^[20]在高浓度(75~100 mmol·L^-1)盐处理下SOD活性也较对照降低。POD活性在PEG处理下均较对照显著上升，但H₂O₂含量在处理后也呈现上升趋势，有报道表明，叶片POD活性的增强可能主要参与生长量的调控，而不是保护植物组织缓解H₂O₂引起的氧化损伤^[21]。CAT是C₃植物中清除H₂O₂关键酶，本研究中，CAT活性在2.5%PEG处理10 d和5.0%PEG处理20 d时迅速上升，可以看出较低浓度干旱胁迫刺激了‘717'杂交杨的CAT活性的提高，而处理时间的延长使得‘717'杨对干旱环境的敏感度降低。在10.0%PEG处理时，CAT活性下降，表明细胞内受到的氧化伤害加剧，这和杨淑红^[22]对‘中红杨'和‘2025'杨在干旱胁迫下的报道结果一致。

APX是叶绿体中清除H₂O₂最重要的酶，GR酶是维持GSH/GSSG (氧化型谷胱甘肽)正常比值、NADPH再生的关键，AsA和GSH本身就是活性氧的清除剂，植物体内适量的AsA、GSH承担着APX、GR作用发挥的重要角色^[23]。本研究中，‘717'杂交杨APX活性和AsA含量均随着PEG浓度的增加而增加，GR活性在2.5%PEG处理10 d时，相对于对照而言有轻微的减弱，而在相同条件下GSH含量却显著的增加，但两者在10.0%PEG处理20 d时都呈一定程度的下降。MDA含量增减趋势和GR活性基本一致，说明MDA含量影响着植物体内抗坏血酸-谷胱甘肽循环。而且，‘717'杂交杨的叶片具有增强AsA再生的能力，GR、APX活性和GSH含量水平的上升可以证明这点。

综合看来，低浓度(2.5%)PEG处理促进了‘717'杂交杨根和茎的增长，而10.0%PEG使其生长显著下降，对‘717'杂交杨产生了毒害作用。随着干旱程度加剧，H₂O₂和MDA含量上升，‘717'杂交杨叶片中ROS发生积累。CAT活性在低浓度(2.5%)PEG处理时较对照出现显著的升高，POD和APX活性随着PEG浓度增加而增强，这些均有利于清除细胞中的ROS。在10.0%PEG处理20 d时，SOD、CAT、GR活性都出现了不同程度的减弱，说明‘717'杂交杨细胞内部活性氧自由基积累过多，膜脂过氧化作用破坏了细胞膜的稳定性，从而抗氧化酶活性降低。在干旱处理下，AsA和GSH含量均高于对照，10.0%PEG处理时GSH含量轻微的减弱。可见低浓度(2.5%) PEG处理下的干旱胁迫刺激了‘717'杂交杨，提高了抗氧化酶活性和抗氧化剂含量，而高浓度(10.0%) PEG处理时，细胞的ROS清除平衡被打破，加剧了氧化伤害。