生物对环境的适应性是生物学和生态学研究的核心内容^[1]。其中，昆虫的耐寒性(cold tolerance)对于揭示昆虫物种的地理分布、种群波动成因和害虫综合控制、天敌的开发利用等具有重要意义。而众多研究表明，诸多的内外部因素如气候的季节性波动、虫体含水量和抗寒物质的积累、冰核物质、地理环境、昆虫世代和发育阶段、低温驯化、食物等都会影响昆虫的耐寒性^[2]；冬季存活与耐寒性是决定一些温带物种种群持续发生的决定因素，特别是低温是决定植食性昆虫及其专性天敌地理分布的直接而关键的因素^[3-4]。因此，研究昆虫的低温适应性，对于揭示其越冬与存活规律，预测其潜在地理分布与区划，揭示种群暴发原因与实施有效控制等均具有重要的理论和实践意义。

刺桐姬小蜂(Quadrastichus erythrinae Kim)是我国一种严重的外来入侵物种，自2005年首次在中国大陆发现以来，目前对刺桐属(Erythrinae sp.)植物造成了严重危害，且分布呈迅速蔓延之势^[5-7]。因此针对刺桐姬小蜂的疫情分析、风险评估及防控研究显得十分重要和迫切。国内外现有研究较少，主要依据各地气象数据库资料开展模型预测，对刺桐姬小蜂在中国的危险性作出综合评价^[8-10]。通过文献查阅结合实地调查发现，刺桐姬小蜂疫区现主要分于广东、广西、海南、福建等省，其中以福建为最高纬度地区^{[5, 10]}，显然，福建种群与其它种群相比，每年接受自然低温驯化的时间更长、次数更多且强度更高；同时，寄主植物刺桐已被广泛引种到高纬度和高海拔区域，为刺桐姬小蜂的入侵提供充足的食物资源，因而该虫具有向上述地区入侵的潜在风险。对此，拟将以入侵害虫刺桐姬小蜂为研究对象，通过测定过冷却点(super cooling point, SCP)和低温暴露试验下的存活率及致死中有效伤害低温累积(median lethal sum of injurious temperature，LSIT₅₀)等指标^[11-12]，以此对刺桐姬小蜂的低温耐受性进行初步评价，为今后预测其适生分布范围提供理论依据。

以刺桐姬小蜂(幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫)为研究对象，供试虫源于2011年7月采自福建省泉州市惠安县崇武古城风景区北侧，寄主样株共10株，同属高感品系刺桐东方变种Erythrina variegate var. orientalis^[5]。取样时，利用高枝剪在每个样株上按上、中、下层取样，各层次又分东、南、西、北4个方位剪取虫瘿密度较高的受害枝20 cm(包括顶梢和嫩叶)，每株共剪取12个受害枝，分别标记后用自封袋封装，带回实验室插入水盆(直径15 cm)在25 ℃、RH 70%±10%、12L:12D条件下水培，收集供试成虫或虫瘿(幼虫和蛹)。

供试成虫采用正趋光性收集，即在室温下将水培受害枝置入黑暗纸箱(40 cm×40 cm×50 cm)中，将指形管(直径1.7 cm，高8.3 cm)插入纸箱上方开孔(直径1.7 cm)，经2~3 d收集足够的雌、雄成虫。依据其体型大小、颜色和产卵器鉴定性别，统计供试成虫的性别和数量。置于相应的供试低温环境中进行试验，测定其存活率。每组试验设3次重复，每次重复共测定30头害虫，以常温条件下的存活率为对照。

幼虫和蛹来源于虫瘿，在自然界受到环境胁迫时处于虫瘿的保护之中，因此供试幼虫和蛹在本次试验中未设置直接裸露于低温环境，而是将供试的虫瘿放入供试低温环境中，待各梯度试验结束时，采用昆虫解剖针小心解剖虫瘿，依据其形态鉴别其所属虫态，分别统计各处理中幼虫和蛹的数量及存活情况。每组试验设3次重复，由于虫瘿中各虫态发育进度不一致，因此每次测定以该虫态样本不少于20头为准，以常温条件下的存活率为对照。

采用铜镍热电偶法在匀速降温(1 ℃·min^-1)的低温环境中(由海尔BCD228-WBSS冰箱制备)测定过冷却点。由于刺桐在福建的秋冬季节落叶，且刺桐姬小蜂在次年春夏之交出新叶期开始危害，表明该虫不以卵在树叶中越冬^[7]，因此测试主要针对刺桐姬小蜂的幼虫、蛹和成虫3个虫态；由于该虫在幼虫和蛹期无法辨识性别，过冷却点的测定不考虑幼虫和蛹的性别。测试时，在双目解剖镜下解剖未羽化的虫瘿，获取并辨明虫态后用滤纸吸干体表水分，用透明胶将其固定在热电偶探针上，保证探针与虫体充分接触，用移液枪头套住探针并裹以棉花以调节降温速率，放入冰箱内测定。各虫态重复测定60~100头。

参照刺桐姬小蜂的发育起点温度(14.47 ℃)^[6]，设定8种梯度低温暴露处理(RH 70%±10%，12L:12D)^[11-12]，分别为：(1) 15 ℃处理，15 ℃×12 h；(2) 10 ℃处理，15 ℃×12 h→10 ℃×12 h；(3) 5 ℃处理，15 ℃×12 h→10 ℃×12 h→5 ℃×6 h；(4) 0 ℃处理，15 ℃×12 h→10 ℃×12 h→5 ℃×6 h→0 ℃×6 h；(5) -5 ℃处理，15 ℃×12 h→10 ℃×12 h→5 ℃×6 h→0 ℃×6 h→-5 ℃×4 h；(6) -10 ℃处理，15 ℃×12 h→10 ℃×12 h→5 ℃×6 h→0 ℃×6 h→-5 ℃×4 h→-10 ℃×4 h；(7) -15 ℃处理，15 ℃×12 h→10 ℃×12 h→5 ℃×6 h→0 ℃×6 h→-5 ℃×4 h→-10 ℃×4 h→-15 ℃×4 h；(8) -20 ℃处理，15 ℃×12 h→10 ℃×12 h→5 ℃×6 h→0 ℃×6 h→-5 ℃×4 h→-10 ℃×4 h→-15 ℃×4 h→-20 ℃×4 h；对照组为25 ℃连续处理全部试验组。其中，5~25 ℃以上温度(包括5 ℃)由PRX-250Q-B型人工气候箱(宁波海曙赛福实验仪器厂)制备，0 ℃以下温度(包括0 ℃)由DC-3015型低温恒温槽(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)中加入酒精制备，重复3次。

随机抽取高感刺桐叶片(含新鲜虫瘿)，按每处理30片叶封紧于自封袋内(须确保各幼虫或蛹的个体数量均大于20头)，成虫则直接置入小试管(直径1.5 cm)中，然后全部样品分别放入锥形瓶(250 mL)中准备上述低温暴露试验，0 ℃及以下低温处理样品切忌虫体暴露或接触酒精环境中。各低温暴露结束后，将处理样品取出并直接放入25 ℃的人工气候箱内，待最后1种处理(-20 ℃处理)结束并25 ℃条件下恢复24 h后，分别对各处理叶片的虫瘿镜检，统计幼虫或蛹的死亡和存活数量。以虫体饱满、色泽光亮作为存活标准，虫体皱缩、体色暗淡虫样判为死亡，虫体干瘪、虫瘿内无虫及有羽化孔者不作统计。

采用方差分析并结合Ducan法比较各虫态的过冷却点。

根据低温暴露试验所获取的原始数据，统计出各虫态在各低温效应后的平均死亡率和校正死亡率，经反正弦平方根进行标准变换后，以死亡率为纵坐标，以温度变化为横坐标作图，比较各虫态校正死亡率沿匀速降温下的变化规律。

采用两种方法估算致死中有效低温累积(LSIT₅₀)评价害虫的耐寒性^{[2, 11-12]}，并比较二者科学性。方法如下：(1) 改进的逻辑斯谛方程：$S\left( {t,T} \right) = {\rm{exp}}(a + b\sum\limits_{i = 1}^n {{t_i}{T_i}} )[1 + {\rm{exp}}(a + b\sum\limits_{i = 1}^n {{t_i}{T_i}} )]$；(2) 改进的双变量逻辑斯蒂方程：$S\left( {{t_i},{T_i}} \right) = {\rm{exp}}[a + b(\sum\limits_{i = 1}^n {{t_i}{T_i} - c} )]/\{ 1 + {\rm{exp}}[a + b(\sum\limits_{{\rm{i = }}1}^{\rm{n}} {{t_i}{T_i} - c} )]\} $。式中, S为死亡率；t为低温胁迫时间；T为低温胁迫温度；a、b常数，-a/b的生物学意义为造成昆虫50%个体死亡的有效低温累积，模型(2) 增加了参数c，其生物学意义为对昆虫造成冷伤害的有效低温累积上限(upper limited sum of chill injurious temperature，ULSCIT)。参数a，b可采用DPS统计软件的麦夸特法进行计算。

一般地，0 ℃或0 ℃以上低温也会对昆虫等变温动物造成伤害，但这种伤害会因评价模型中低温累积的计算方法(即温度因素值为0 ℃)出现缺失的结果(计算的累积值为“0”)，无法反映低温随时间的实际累积伤害作用。因此，在设置的温度大于或等于0 ℃时，需对各处理温度重新赋值才能反映胁迫时间×温度的胁迫效应。参照剌桐姬小蜂卵、幼虫和蛹的发育起点温度，本试验将15 ℃赋值为0，在此基础上每下降1 ℃，其赋值相应减1，具体为：令T_{(15 ℃)}=0，T_{(10 ℃)}=-5，T_{(5 ℃)}=-10，T_{(0 ℃)}=-15，T_{(-5 ℃)}=-20，T_{(-10 ℃)}=-25，T_{(-l5 ℃)}=-30，T_{(-20 ℃)}=-35。然后采用模型(2) 进行拟合，据此计算LSIT₅₀。其中，死亡率即各重复中校正死亡率的均值。

刺桐姬小蜂不同虫态的过冷却点各不相同，其中雌成虫的平均值最低，达到-12.4 ℃，其次是雄成虫、蛹和幼虫。方差分析表明，仅雌成虫与其它虫态之间差异显著(P < 0.01)，其余虫态之间差异不显著(表 1)，表明环境温度在其冰点温度持续下降时，各虫态体液的结冰顺序依次是：幼虫、蛹和雄成虫，雌成虫，在一定程度上反应了各虫态的组织和细胞对冰点低温下的抗结冰能力。

各虫态死亡率随着暴露温度的降低而显著上升，且以5 ℃为拐点，类似逻辑斯蒂曲线；在不同降温阶段，死亡率变化的趋势也略有不同(图 1)。当温度从25 ℃降低到10 ℃时，各虫态死亡的速率总体呈缓慢增长趋势，其中以雄成虫死亡率最高；当温度从10 ℃降低5 ℃时，各虫态反应斜率加大，表明各虫态死亡率增长加快，其中以幼虫死亡率最高且增长最快，表明幼虫对降温过程反应最敏感；但从总体看，当温度高于5 ℃，刺桐姬小蜂各虫态死亡率都低于20%，表明各虫态的多数个体对这一范围的降温度过程不敏感。然而，当温度从5 ℃降低至-5 ℃时，各虫态进一步死亡明显加快和增多，且死亡率差异较大，总体表现为：雄成虫＞雌成虫＞蛹＞幼虫，表明它们对这一范围内的降温耐受性依次增强，幼虫和蛹的死亡速度相对较慢，死亡个体相对较少，分别有近40%和60%存活，但成虫接近全部死亡；当温度从-5 ℃继续下降到-20 ℃时，成虫、蛹和幼虫相继全部死亡，但成虫仅在-10 ℃下全部死亡，蛹和幼虫分别可持续到-15 ℃和-20 ℃全部死亡，从死亡强度上看，蛹体在降温过程中死亡率曲线更似逻辑斯蒂曲线，而幼虫在0 ℃下近匀速死亡，两条曲线之间合围的面积即二者抵御极端低温的差距，表明幼虫对低温的耐受性则更为持久。

	图 1 不同虫态校正死亡率与低温胁迫的关系 Fig. 1 Relationship between revised mortality of different stages and low temperatures
图选项

分别采用两个模型拟合刺桐姬小蜂各虫态和种群总体低温暴露死亡率与低温累积的关系，并据此计算致死中有效伤害低温累积LSIT₅₀。结果表明：刺桐姬小蜂各虫态的低温暴露死亡率变化规律均符合该逻辑斯谛曲线模型Ⅰ和模型Ⅱ(P < 0.01) (表 2)。比较不同虫态的LSIT₅₀，各虫态对低温的耐受性表现为：幼虫＞蛹＞雌成虫＞雄成虫，表明刺桐姬小蜂幼虫较其它虫态更耐低温，且种群总体LSIT₅₀可用于比较刺桐姬小蜂与其他种群或其他昆虫的低温耐受性。与模型Ⅰ相比，改进后的模型Ⅱ拟合的结果与结论与模型Ⅰ基本一致，但模型Ⅱ的LSIT₅₀值略高。

刺桐姬小蜂是国家林业局2005年发布的重要外来林业有害生物之一，目前实际分布北界为福建^{[5-6, 10]}，由于福建以北广泛分布了其嗜食寄主，且每年都受到北方寒潮的自然“驯化”，因而极有可能突破低温限制向高纬度或高海拔地区入侵。研究表明：不同虫态的过冷却点值均低于-10.0 ℃，仅雌成虫与其它虫态之间差异极为显著(P < 0.01)，属耐结冰型；各虫态死亡率均随着温度降低而增加，且超过80%的个体在5 ℃以下的低温环境中死亡，表明5 ℃及以下低温对刺桐姬小蜂各虫态的存活影响最大，其中幼虫对5 ℃以下低温耐受性最强；两个逻辑斯蒂模型均能很好地拟合低温暴露死亡率与低温累积的关系(R²>0.98，P < 0.01)，仍以幼虫LSIT₅₀值最高，从理论上进一步验证了幼虫对低温耐受性最强；同时，模型Ⅱ兼顾了昆虫冷伤害的上限温度(ULCIZ)对害虫的影响，较真实地模拟自然条件下昆虫所经历的持续降温过程，可为刺桐姬小蜂在低温胁迫下耐受性的定量评价、疫情分布和生物风险评估等提供可供选择的科学依据。

昆虫在低温下的存活状态及过冷却点测定是评价其耐寒性的有效手段。本研究发现刺桐姬小蜂的过冷却点存在虫态差异性，与RENAULT et al ^[13]研究结论一致，其中成虫的过冷却点最低，这可能与成虫的羽化季节和裸露生活有关；与成虫相比，幼虫的孵化和危害均在虫瘿组织内完成，可避免直接接触低温胁迫环境，或虫瘿组织对于短期低温胁迫具有缓冲作用，因而虫体受到的低温伤害影响最小，也可能导致这一差异。参照前人的划分标准，刺桐姬小蜂的过冷却点属于耐结冰型^[14]。然而，过冷却点在测定时供试昆虫已经处于死亡状态，并不能直接反映该虫对极端低温的适应性^[13-14]，只能作为全面了解昆虫耐寒性的辅助手段^[15]。因此，考虑到我国南方多数地区不存在低于-5 ℃的持续低温，因此过冷却点的测定对于预测和评估该虫在自然界的越冬状态没有实际意义，但对于评估该虫是否能适应低温，继续向高纬度或高海拔地区迁移具有参考价值。此外，外在环境因素和昆虫内在特性如食物种类、发育状态、含水量、生化物质以及冰核物质等因素不仅可能单独直接作用于过冷却点，也可能对耐寒性评价结果产生交互影响^[7]，值得今后进一步研究。

在各低温胁迫下，基于不同虫态死亡率的低温耐受性评价结果与其过冷却点评价结果基本一致，仅雌雄成虫之间存在差异，但这种差异总体上不影响该虫向北入侵和扩散的风险评价。成虫在低温下的死亡率大于幼虫和蛹，表明成虫的耐受性最弱，也可能与成虫的生活季节和裸露环境有关，而幼虫和蛹因生活于虫瘿内而受益于虫瘿对低温胁迫的缓冲作用。但为了模拟和评价各虫态在自然环境中对低温胁迫的耐受性和北迁的风险，各供试的幼虫和蛹体均采用自然虫瘿，只有成虫处于裸露状态，可能也是导致成虫与幼虫、蛹体低温耐受性差异的因素之一。研究还发现，雌成虫死亡率低于雄成虫，并不能充分证明雄成虫对低温的耐受性弱于雌成虫，因为跟自然界多数昆虫的雄性个体寿命也短于雌性个体寿命。

据文献记载，刺桐姬小蜂可能起源于东非，首次在毛里求斯、留尼旺、美国夏威夷、新加坡、中国(台湾、广东与福建)等地发现，是广泛分布于热带和南亚热带地区的入侵物种^[16]。然而，自该物种成功入侵我国华南以来，现已研究并掌握了福建种群的发育起点温度是14.47 ℃^[6]。依据本研究结果，推测20~14.47 ℃可能是种群的低适温区，14.47~5 ℃是其停育低温区，昆虫新陈代谢激烈下降并出现冷昏迷状态；低于5 ℃便是致死低温区，短时间内即可死亡。由于该虫每年都会接受来自我国北方寒流的“驯化”，其亚致死低温区还可能会进一步降低，因而具有向我国高纬度继续入侵的潜在高风险。同时，对于入侵生物的耐寒性研究，一般要结合原产地的温度数据来进行比较，以便获得更科学的证据，但由于该虫并非从原产地直接入侵我国，而是从邻近国家或地区以渐进方式逐步从低纬向高纬入侵，因此具体引入何地区的气象数据的问题，可在今后的工作中补充研究。

一般地，昆虫耐寒性评价指标包括生物学、生理学、遗传学及分子生物学等多项指标^{[15, 17-18]}，其中生物学指标通常包括存活率或死亡率、过冷却点及冰点、致死中温度、冷伤害上限温度和有效累积低温等，生理学指标如冰核、水分、小分子抗寒物质和热滞蛋白(THP)等。随着分子生物学技术的迅速发展，围绕20多种热滞蛋白等相关基因的克隆和表达研究^[18]，进一步将分子生物技术基因组学、蛋白组学与生物学、生理学、遗传学有机串联起来，多角度系统深入地揭示刺桐姬小蜂的低温适应及其机制，并将其与生物学、地理区划、疫情监测和有效控制等有机结合，是今后研究重点关注的方向。当然，昆虫在低温胁迫下的死亡率目前被认为是一种可信赖的耐寒性评价指标^[3]，在获取供试昆虫种群的死亡率后，通常采用单变量Logistic非线性回归、双变量Logistic非线性回归或直线回归等模型进行综合评价^{[13, 19]}，然而只适用于恒定低温胁迫下的昆虫耐寒性评价。本研究通过匀速降温的低温胁迫方法来模拟自然降温过程并测定其死亡率，首次采用修正的模型评价刺桐姬小蜂的耐寒性，试图获得更接近自然的结果，可为今后研究其他外来入侵害虫的耐寒性提供备选方法和模型，具有一定意义。此外，刺桐姬小蜂卵粒微小、颜色较浅导致在幼嫩组织中不易获取，因此无法获得足够的虫卵样本测定过冷却点和开展低温暴露实验；同时今后还应选择不同地区、季节和不同寄主的刺桐姬小蜂种群进行低温耐受性的比较；或采用控制单一变量法，在恒温不同时间或同一时间不同温度条件下测定和比较低温耐受性，从而建立更科学的低温耐受性评价体系。