文章信息
- 赵旭东, 李周岐, 邓鹏
- ZHAO Xudong, LI Zhouqi, DENG Peng
- 杜仲杂交子代优良单株分子标记辅助选择
- Marker-assisted selection in superior individuals of Eucommia ulmoides Oliver's hybrid progenies
- 森林与环境学报,2017, 37(3): 372-378.
- Journal of Forest and Environment,2017, 37(3): 372-378.
- http://dx.doi.org/10.13324/j.cnki.jfcf.2017.03.021
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文章历史
- 收稿日期: 2017-01-12
- 修回日期: 2017-04-17
杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是杜仲科杜仲属(单科单属)的落叶乔木[1],是中国特有的名贵经济树种和世界上发展潜力最大的优质胶源树种[2]。杜仲以皮入药,具有抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力等药效[3-4]。杜仲胶具有低温可塑、形状记忆、透雷达波、耐磨、耐腐蚀、减振、隔音等特性[5]。此外杜仲还是很好的用材树种、园林绿化及水土保持树种,具有极高的开发利用价值[6]。
近年来,国内一些林业科学研究单位在杜仲常规育种、生物技术育种等方面做了大量研究,并取得了一定成果[7]。在有关杜仲杂交育种方面,魏永成等[8]、魏军坤[9]对杜仲杂交后代群体的遗传变异进行了研究。但由于杜仲的遗传基础研究比较薄弱,对其许多性状的早期选择和高效遗传改良等问题仍无法从根本上得到解决,从而制约着杜仲良种选育工作的进程。利用现有的杜仲资源开展杂交育种,并寻找有效的早期选择方法、提高选择效率、缩短育种周期,应该成为杜仲遗传改良工作的发展方向。随着许多树种的高密度遗传连锁图谱的构建[10-11]完成,分子标记辅助选择(marker-assisted selection,MAS)技术也被广泛地应用到林木良种选育的工作中来[12]。
本研究以从杜仲杂交子代中初选的41株优良单株为材料,在李煜[13]进行杜仲高密度遗传连锁图谱的构建和重要性状(quantitative trait locus, QTLs)的分子标记定位方面的研究成果基础上,挑选与目标性状QTLs关联紧密的分子标记,对杜仲优良单株群体进行分子标记辅助选择研究,建立杜仲分子标记辅助选择方法,同时结合其表型性状的测定进行表型选择,选出不同目标性状表现优良且稳定的优良单株,加速杜仲新品种选育进程。
1 材料与方法 1.1 试验材料2009年,以“华仲2号”、“小叶”、“大果”、“大叶”和“闫雌”5个杜仲优良品种或无性系作为杂交母本,“龙拐”、“紫叶”、“洛超3号”、“秦仲1号”和“秦仲2号”5个品种或无性系作为杂交父本,采用析因交配设计杂交得到25个组合的种子。2010年,对经播种育苗获得杂交子代的6 000多株杜仲进行家系田间对比试验[14],并对3年生和4年生的个体的表型性状进行测定,利用树高和地径两个生长指标筛选得到的41株作为初选优良单株[9],定植于西北农林科技大学林学院实验苗圃。
1.2 研究方法 1.2.1 分子标记的选择现已构建的林木遗传连锁图谱密度普遍偏低,不同性状QTL有关的分子标记用于检测的数量有限。参照李煜[13]最新对杜仲高密度遗传连锁图谱构建与重要数量性状的分子标记定位的研究结果,在其已定位的分子标记的基础上,根据性状相关性(与不同性状相关的QTL往往聚集在某一连锁群的同一区域,可以用同一个QTL表征不同性状)、贡献率(QTL能解释的变异占总变异的百分率)、QTL稳定性(连续5 a对表型性状的观测,选出大多数在2~3 a可以表征相关性状的QTL)等因素选择了6个QTL区域(共10个标记),在连锁群LG24上确定与树高相关的QTL(Dht4-4),在连锁群LG1上确定与地径相关的QTL(Dbd4-1),在连锁群LG21和LG22上确定与树高地径相关的4个QTLs(Dht4-2,Dht5-3,Dht3-3,Dht5-4),在连锁群LG10上确定与产叶量相关的QTL(Dtdw5-2),在连锁群LG1上确定与杜仲胶含量相关的QTL(Deur4-1),在连锁群LG7上确定与绿原酸和芦丁含量相关的两个QTLs(Dca3-3,Dru5-2) (表 1)。
QTL区域编号Number of QTL region | 表征性状Phenotypic trait | 数量性状基因座QTL | 连锁群 Linkage group | 标记Marker | 引物或引物组合Primer or primer combination | 贡献率Contribution rate/% | 重组率Recombination rate/% |
1 | 树高Tree height | Dht4-4 | LG24 | DZ200-350 | DZ200 | 27.1 | 0.0 |
2 | 树高和地径Tree height and ground diameter | Dht3-3 | LG22 | em15me23-360 | em15/me23 | 33.3 | 2.6 |
Dht5-4 | LG22 | em6me8-260 | em6/me8 | 67.7 | 0.0 | ||
Dht4-2 | LG21 | UBC881-820 | UBC881 | 26.6 | 6.1 | ||
Dht5-3 | LG21 | em5me7-530 | em5/me7 | 70.1 | 4.0 | ||
3 | 地径Ground diameter | Dbd4-1 | LG1 | em12me11-300 | em12/me11 | 16.8 | 0.0 |
4 | 产叶量Leaf yield | Dtdw5-2 | LG10 | em31me26-160 | em31/me26 | 19.2 | 1.1 |
5 | 胶含量gutta-percha content | Deur4-1 | LG1 | em49me3-150 | em49/me3 | 29.1 | 0.0 |
6 | 绿原酸和芦丁含量 Chlorogenic acid and rutin content | Dca3-3 | LG7 | em10me28-170 | em10/me28 | 21.2 | 1.0 |
Dru5-2 | LG7 | em7me28-240 | em7/me28 | 19.9 | 0.0 |
2013—2015年,连续3 a在10月中旬用直尺、标杆和电子游标卡尺等对优良单株的树高(m)、地径(cm)、分枝数(个)和分枝叶片数(片)4个生长性状进行测量和统计。从植株树冠上中下3个部位分别选取1个分枝统计叶片数,求平均数即为分枝叶片数。并从植株树冠上中下3个部位随机各采集3片,共9片叶子,再从每个部位选取的叶子中分别抽取1片,烘干后称重,求平均值得到叶片干质量(g)。产叶量=分枝数×分枝叶片数×叶片干质量。从植株树冠上中下3个部位各随机采集5片叶子共15片为1份(鲜质量约50 g),共采集6份,后立即进行杀青烘干,取3份每份研磨过筛并称量约0.5 g,用于绿原酸和芦丁含量的测定;3份每份研磨成粉末,称量约5 g,用于杜仲胶含量的测定。根据陆志科等[15]建立测量杜仲胶含量的优化方法和郑德勇等[16]、魏军坤等[17]建立的高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测量杜仲叶片中绿原酸和芦丁含量的方法,对4~6年生优良单株叶片中杜仲胶、绿原酸和芦丁含量进行测定,计算样品进行3次技术重复测得数据的平均值。
1.2.3 分子标记辅助选择2015年4月,采集6年生41株优良单株新生的嫩芽,利用Sure Plant DNA Kit(北京康为试剂生物科技有限公司)提取样品DNA,用核酸蛋白检测仪检测DNA的含量和纯度[18-19]。根据李煜[13]采用的SRAP、ISSR、SSR分子标记技术对样品DNA进行PCR扩增及电泳检测,并依次进行聚丙烯酰胺凝胶的固定、染色、显色、拍照。最后根据电泳图统计每个单株的标记类型,有记为“1”,无记为“0”;标记的效应值用E= R (1-r)计算,其中E为有某个标记的效应值,R为相应QTL的贡献率,r为该标记与相应QTL的重组率。根据10个分子标记对初选的41株优良单株DNA电泳检测的结果,对各表型性状QTL关联的所有单个分子标记的效应值和标记组合的效应值之和进行计算并统计,分别与4~6年生表型数据进行相关性分析,筛选出与相关性状关联最密切的QTLs用于分子标记辅助选择。单标记控制的性状,按分子标记效应值的大小由高到低进行排序;标记组合控制的性状,按分子标记组合效应值之和的大小由高到低进行排序[20]。
2 结果与分析 2.1 分子标记的检测效率分析对各性状个体表型值与对应的单个分子标记效应值和分子标记组合效应值之和进行相关性分析,其中在与树高相关的标记及标记组合中,QTL(Dht4-4) 对应的分子标记效应值与树高表型数据的相关系数随着年龄在不断增加,且在6年生P < 0.05,说明该标记与树高性状在6年生达到显著正相关,用其进行树高性状的分子标记辅助选择效果最佳。同理确定地径相关的QTL组合(Dbd4-1和Dht3-3),与产叶量相关的QTL(Dtdw5-2),与杜仲胶含量相关的QTL(Deur4-1),与绿原酸含量相关的QTL(Dca3-3) 和与芦丁含量相关的QTL(Dru5-2) (表 2)。在与树高、地径有关的单个分子标记和标记两两组合中已筛选得到检测效率较高的标记或标记组合,考虑到3个及以上分子标记组合的低相关性及繁冗性,并未在表 2中详细列出。
性状Phenotypic trait | 数量性状基因座QTL | 标记及标记组合Markers or marker combination | 效应值或效应值之和与不同年龄表型值的相关性 Correlation between the effect vaule or sum of effect and phenotypic value | ||
4 | 5 | 6 | |||
树高Tree height | Dht3-3 | em15me23-360 | -0.374* | -0.337* | -0.329* |
Dht5-4 | em6me8-260 | -0.194 | -0.193 | -0.115 | |
Dht4-2 | UBC881-820 | -0.109 | -0.139 | -0.150 | |
Dht5-3 | em5me7-530 | -0.271 | -0.299 | -0.334* | |
Dht4-4 | DZ200-350 | 0.408** | 0.448** | 0.543** | |
Dht3-3 & Dht5-4 | em15me23-360 & em6me8-260 | -0.377* | -0.352* | -0.294 | |
Dht3-3 & Dht4-2 | em15me23-360 & UBC881-820 | -0.352* | -0.347* | -0.349* | |
Dht3-3 & Dht5-3 | em15me23-360 & em5me7-530 | -0.415** | -0.409** | -0.427** | |
Dht3-3 & Dht4-4 | em15me23-360 & DZ200-350 | 0.024 | 0.079 | 0.075 | |
Dht5-4 & Dht4-2 | em6me8-260 & UBC881-820 | -0.213 | -0.234 | -0.186 | |
Dht5-4 & Dht5-3 | em6me8-260 & em5me7-530 | -0.309 | -0.328* | -0.298 | |
Dht5-4 & Dht4-4 | em6me8-260 & DZ200-350 | 0.149 | 0.178 | 0.224 | |
Dht4-2 & Dht5-3 | UBC881-820 & em5me7-530 | -0.282 | -0.325* | -0.359* | |
Dht4-2 & Dht4-4 | UBC881-820 & DZ200-350 | 0.206 | 0.212 | 0.196 | |
Dht5-3 & Dht4-4 | em5me7-530 & DZ200-350 | 0.109 | 0.118 | 0.080 | |
地径 Tree height | Dht3-3 | em15me23-360 | -0.175 | 0.084 | 0.199 |
Dht5-4 | em6me8-260 | -0.035 | -0.011 | 0.057 | |
Dht4-2 | UBC881-820 | -0.066 | -0.062 | -0.213 | |
Dht5-3 | em5me7-530 | 0.004 | -0.017 | -0.032 | |
Dbd4-1 | em12me11-300 | -0.109 | 0.193 | 0.382* | |
Dht3-3 & Dht5-4 | em15me23-360 & em6me8-260 | -0.139 | 0.048 | 0.170 | |
Dht3-3 & Dht4-2 | em15me23-360 & UBC881-820 | -0.176 | 0.017 | -0.010 | |
Dht3-3 & Dht5-3 | em15me23-360 & em5me7-530 | -0.110 | 0.044 | 0.108 | |
Dht3-3 & Dbd4-1 | em15me23-360 & em12me11-300 | -0.194 | 0.189 | 0.396* | |
Dht5-4 & Dht4-2 | em6me8-260 & UBC881-820 | -0.071 | -0.051 | -0.109 | |
Dht5-4 & Dht5-3 | em6me8-260 & em5me7-530 | -0.021 | -0.019 | 0.017 | |
Dht5-4 & Dbd4-1 | em6me8-260 & em12me11-300 | -0.091 | 0.115 | 0.278 | |
Dht4-2 & Dht5-3 | UBC881-820 & em5me7-530 | -0.046 | -0.058 | -0.182 | |
Dht4-2 & Dbd4-1 | UBC881-820 & em12me11-300 | -0.112 | 0.084 | 0.108 | |
Dht5-3 & Dbd4-1 | em5me7-530 & em12me11-300 | -0.084 | 0.140 | 0.279 | |
产叶量Leaf yield | Dtdw5-2 | em31me26-160 | 0.512** | 0.583** | 0.633** |
胶含量Leaf gutta- percha content | Deur4-1 | em49me3-150 | 0.360* | 0.330* | 0.350* |
绿原酸含量Chlorogenic acid content | Dca3-3 | em10me28-170 | -0.079 | 0.103 | 0.335* |
Dru5-2 | em7me28-240 | -0.248 | -0.152 | -0.074 | |
Dca3-3 & Dru5-2 | em10me28-170 & em7me28-240 | -0.227 | -0.034 | 0.304 | |
芦丁含量Rutin content | Dca3-3 | em10me28-170 | -0.226 | -0.120 | -0.108 |
Dru5-2 | em7me28-240 | 0.287 | 0.379* | 0.443** | |
Dca3-3 & Dru5-2 | em10me28-170 & em7me28-240 | 0.043 | 0.180 | 0.232 | |
1) *P≤0.05,**P≤0.01。 |
依据1.2.2的方法对优良单株进行表型测定,需确定比较合适的年限。树木表型性状间的相关系数反映了性状间的相关程度,它可以为林木早期表型选择年限的制定提供理论参考[8]。对4~6年生杜仲优良单株表型数据进行不同年龄间的相关性分析,结果(表 3)表明,4年生与5年生优良单株的树高、产叶量、叶片胶含量的相关系数分别为0.868、0.878、0.460,达到极显著水平,地径和芦丁含量的相关系数分别为0.331、0.347,达到显著水平;4年生与6年生优良单株的树高、产叶量、叶片胶含量的相关系数分别为0.823、0.836、0.364,达到极显著水平,芦丁含量的相关系数为0.357,达到显著水平,而地径和绿原酸含量的相关系数分别为0.159、0.192,未达到显著水平;5年生与6年生优良单株的6个表型性状的相关系数均大于0.6,均达到极显著水平。综上表明,杜仲早期(6年生以前)的表型性状易受环境影响,部分性状相关性不高,而5年生与6年生各表型性状的相关性较高,就当前而言,以6年生优良单株表型数据进行表型选择最为适宜,后根据不同的选育目标,对优良单株由高到低依次排列。
性状Phenotypic trait | 年龄间Year-to-year | ||
4~5 | 4~6 | 5~6 | |
树高Tree height | 0.868** | 0.823** | 0.947** |
地径Ground diameter | 0.331* | 0.159 | 0.913** |
产叶量Leaf yield | 0.878** | 0.836** | 0.957** |
胶含量gutta-percha content | 0.460** | 0.364** | 0.913** |
绿原酸含量Chlorogenic acid content | 0.531** | 0.192 | 0.697** |
芦丁含量Rutin content | 0.347* | 0.357* | 0.939** |
1) *P≤0.05,**P≤0.01。 |
对入选的与优良单株性状相关的6个标记或标记组合按效应值或标记组合效应值之和由高到低进行排序,结合杜仲6年生优良单株表型数据的排序结果,根据不同的选育目标对优良单株进行选择。
与树高相关的QTL(Dht4-4),取标记效应值前20优良单株与树高表型性状前20优良单株,检测结果一致的单株有18株优良单株(占90%),编号为3-29,1-1,2-32,2-36,4-83,5-41,5-126,4-48,4-44,1-100,1-49,2-23,3-44,22-11,22-22,2-34,3-55,5-152。41株优良单株树高平均值为4.32 m,入选的18株树高平均值为4.65 m,较优良单株群体平均值提高7.64%。
同理,与地径相关的两个QTLs(Dht3-3,Dbd4-1),检测结果一致的单株有11株优良单株(占55%),编号为3-55,5-33,5-41,5-54,5-126,7-46,16-40,22-11,22-22,23-14,25-82。41株优良单株地径平均值为48.03 mm,入选的11株地径平均值为50.50 mm,较优良单株群体平均值提高5.14%。
与产叶量相关的QTL(Dtdw5-2),检测结果一致的单株有17株优良单株(占85%),编号为5-54,2-36,23-14,5-124,5-33,8-72,2-20,3-55,4-30,4-83,3-29,4-44,3-37,2-23,16-40,1-49,1-100。41株优良单株产叶量平均值为242.90,入选的17株产叶量平均值为367.88,较优良单株群体平均值提高51.45%。
与杜仲胶含量相关的QTL(Deur4-1),检测结果一致的单株有16株优良单株(占80%),编号为1-1,5-54,5-41,1-40,1-45,1-19,2-23,5-35,5-126,4-83,1-49,3-44,3-55,5-129,2-36,5-124。41株优良单株叶片含胶量为7.27%,入选的16株含胶量平均值为10.63%,较优良单株群体平均值提高46.22%。
与绿原酸含量相关的QTL(Dca3-3),检测结果一致的单株有18株优良单株(占90%),编号为1-1,1-40,2-36,1-45,1-100,1-49,7-46,5-35,4-89,22-11,2-23,1-19,5-33,16-40,5-152,5-126,6-30,5-54。41株优良单株叶片绿原酸含量平均值为1.22 mg·g-1,入选18株绿原酸含量平均值为1.93 mg·g-1,较优良单株群体平均值提高58.20%。
与芦丁含量相关的QTL(Dru5-2),检测结果一致的单株有16株优良单株(占80%),编号为1-1,1-49,2-36,5-129,2-32,5-152,5-124,4-44,17-27,5-126,5-149,5-33,3-44,23-14,1-45,4-48。41株优良单株叶片芦丁含量平均值为0.39 mg·g-1,入选16株芦丁含量平均值为0.53 mg·g-1,较优良单株群体平均值提高35.90%。
3 讨论 3.1 已定位分子标记的局限性对于林木而言,像农作物一样建立高世代群体来构建遗传连锁图谱较为困难,林木中通常采用F1群体来构建遗传图谱。本研究中参照李煜[13]的杜仲高密度遗传连锁图谱是基于家系(F1群体)水平构建的,并在其定位重要数量性状的基础上选择与相关性状QTL紧密联系的分子标记,后用于从不同家系杂交子代中初选的优良单株群体的分子检测,两者是不同的群体,结果肯定会出现一定的偏差。另外优良单株是不同亲本组合的杂交后代,其在进行减数分裂时基因原有的连锁关系被打破,导致基因的遗传距离发生了变化,与QTL关联紧密的标记效应值发生改变,又QTL在年份间存在不稳定表达的现象,这是基因时空表达、树木的成熟效应、环境影响等多种因素共同作用的结果,同样影响分子标记选择的效果。所以必须通过表型性状与其相对应的分子标记或标记组合的相关性分析进行效率性检测,找出与杜仲特定性状紧密相关的分子标记或标记组合,才可以在今后对杜仲植株进行早期分子检测,提早识别和选择数量性状变异,提高选择效率和精度,加快林木选育步伐。
3.2 杜仲早期表型选择年限的确定林木群体的经济性状,绝大多数属于数量性状。数量性状是连续变异的性状,易受外界环境的影响,尤其在早期植株本身生长速率较快,各表型性状表现不太稳定,如果过早对其进行表型测定,可能会造成过多淘汰从而丢失一部分表现优良的植株,不利于优良单株的表型选择。过晚对其进行表型选择虽比较准确但年限又太长,不利于研究的进展,所以需要在早期确定适宜的年限来进行表型选择,此时表型性状的稳定性即是观测的重要指标。本研究依据相邻年龄间表型性状的相关性分析结果可以提供很好的参考价值。另外在早期进行表型选择,可以考虑采取一些必要的措施来尽量弥补过早选择带来的影响,如适当增大选择范围,减小选择差,增加入选率等,以此防止优良基因型的流失。
3.3 分子标记辅助选择效率分析与多个性状相关的QTLs聚集在一起的现象表明基因组区域的一些主效基因存在“一因多效”的现象[21-23]。魏永成[14]和魏军坤[9]等在对杜仲杂交后代各性状间的相关性研究中,发现树高和地径两个性状呈极显著正相关,即树高性状表现优良的个体,在地径性状上也表现良好,可对这两个性状同时进行改良,并进行相关选择。后期又在绿原酸和芦丁这两个性状上发现同样的性状相关。利用杜仲性状的相关性,可以在接下来的分子标记辅助选择研究中,考虑对两个关联性状选择一个或多个表征性状稳定、筛选效率较高的分子标记同时对这两个性状进行联合选择,间接降低分子标记选择的实验成本。
LANDA et al[24]和WU[25]发现分子标记选择与表型选择的效率相比,主要取决于性状的狭义遗传力大小以及标记所解释的加性遗传方差。当标记解释的加性遗传方差比率高于性状狭义遗传力时,分子标记与表型的同时选择比单单对表型的选择的效率要高得多。魏军坤[9]发现杜仲的树高、地径、产叶量、叶片杜仲胶含量、绿原酸含量和芦丁含量等属于高遗传力性状,LI et al[26]对标记所解释的加性遗传方差进行了一定的阐述,确定采用分子标记与表型的同时选择比较有效。经表型选择和分子标记辅助选择的叶片含胶量较高的16株优良单株,其胶含量的平均值较目前已评定含胶量最高的品种-秦仲一号(3.57%)[27],还要高7.06%。选择出的不同性状表现优良的植株均含有该性状的优良基因型,除对其繁殖和推广应用外,还应收集到基因库(收集圃)予以保存,以供今后的开发和利用。
3.4 杜仲分子标记辅助选择的展望由于农作物个体小,生长周期短,育种方法多样等优点,目前分子标记辅助选择已在小麦[28]、棉花[18]、大豆[29]等农作物研究上取得较大的进展。相比于农作物,林木具有个体大不易操作,杂合度高,前期生长缓慢等缺点,寻找早期选择方法和缩短选育年限是急需解决的问题,因此确定与性状相关的QTL,用于性状的遗传改良对于林木具有更加重要的指导意义。杜庆章[30]初步建立了毛白杨基因标记辅助选择策略,并利用多个优势位点联合体对杂交作图群体进行了优良单株个体的选择工作。而在杜仲育种中并未发现开展与分子标记辅助选择的工作,建立相应的分子标记辅助选择体系显得尤为重要。
4 结论杜仲的早期表型选择以达到5~6年生为宜。本研究确定了杜仲的分子标记辅助选择育种体系,首次基于基础性研究结果真正开展杜仲优良单株辅助选择的研究工作。在杜仲家系(F1) 水平定位得到与相关表型性状关联紧密的分子标记,将其在初选优良单株群体中加以验证。通过优良单株表型值与对应分子标记效应值或标记组合效应值之和的相关性分析,筛选出6个分子标记或标记组合进行分子标记辅助选择,与表型选择的结果一致性较高,间接验证建立的杜仲分子标记辅助选择体系选择效率高效。利用构建的杜仲分子标记辅助选择体系,在早期对植株的表型性状进行分子检测,提早确定植株数量性状的表现优良,为杜仲的快速选育提供新的科学方法。
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