倒木作为森林生态系统结构和功能的重要组成要素，在维持森林生态系统稳定性、林木更新、生物多样性保育和水土保持等方面发挥着十分重要的作用^[1]，同时，倒木也是森林生态系统中重要的碳库，对森林生态系统物质循环产生重要的影响^[2]。国外对倒木的研究开始较早，研究地点多为美国、加拿大和北欧等温带森林，研究内容主要集中于倒木对森林生态系统功能、倒木呼吸和倒木分解率等方面^[3-5]。中国对倒木的研究起步较晚，近年来，一些学者在倒木呼吸、生态功能和分解动态等方面进行研究^[6-8]，研究区域主要分布在长白山、大小兴安岭、鼎湖山、哀牢山、天宝岩等地^[9-11]，其中对温带森林的研究较全面，而对亚热带森林的关注相对较少。

天宝岩国家级自然保护区的长苞铁杉 (Tsuga longibracteata W. C. Cheng) 原始林是中国亚热带地区扁平叶型常绿针叶林的典型代表之一，其分布面积为186.7 hm²，其中，纯林占20 hm²，它在维持森林生态系统平衡稳定、水源涵养和调节区域气候等方面发挥着重要作用^[12-13]。然而，由于长苞铁杉林的立地条件较差、土层较薄，一旦遭到破坏则难以恢复，更新困难也已成为长期困扰其保护和重建的关键问题^[14-15]。纤维素不仅是世界上最丰富的可再生天然有机物，也是自然界中最重要的碳源物质之一。由于纤维素结晶区域分子排列较为整齐、有规律并且密度较大等特点，因此需要用纤维素酶进行水解^[16]，通过对长苞铁杉倒木中具有高产纤维素酶菌株的羧甲基纤维素 (carboxymethyl cellulose, CMC) 酶活性进行研究，分析长苞铁杉倒木的分解机理，可为长苞铁杉的天然更新提供理论依据。

1 研究区概况

天宝岩国家级自然保护区位于福建省三明市 (北纬25°50′51″~26°1′20″，东经117°28′3″~117°35′28″)，区域范围包括永安市上坪、青水和西洋3个乡 (镇) 的10个行政村。天宝岩最高海拔1 604.8 m，最低处580 m，保护区核心区距永安市区36 km，属中亚热带海洋性季风气候区，年平均气温15 ℃，无霜期约290 d。全年雨量适中，年降水量2 039 mm，其中5~9月降水量最大，相对湿度均大于80%，保护区森林覆盖率达98%。保护区内土壤呈酸性，海拔800 m以下为红壤，800~1 350 m为黄红壤，1 350 m以上为黄壤。由于天宝岩气候适宜，四季分明且水、热、光等条件优越，因此保护区内物种极其丰富，包含了许多中国中亚热带地区的植被类型，是少有的生物多样性和物种基因库均较为丰富的地区之一。

2 材料与方法 2.1 试验材料与培养基

试验材料为在天宝岩国家级自然保护区内采集的长苞铁杉腐朽倒木。

试验所用的仪器主要有恒温培养箱、全自动灭菌锅、电子天平、电磁炉、水浴锅、烘干机、控温摇床、pH酸度计、离心机、分光光度计。试验所用的试剂主要有羧甲基纤维素钠 (carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na) 溶液、pH=4.8醋酸缓冲液、3, 5-二硝基水杨酸 (3, 5-dinitrosalicylic acid，DNS) 试剂。试验所用的培养基主要有滤纸培养基、马铃薯葡萄糖琼脂 (potato dextrose agar，PDA) 培养基、赫奇逊氏无机盐培养基、刚果红纤维素培养基、产酶培养基。

2.2 试验方法 2.2.1 高产纤维素酶菌株初筛

将所采集的腐烂木材样品置于三角瓶中用无菌水浸泡，摇床匀速振荡30 min，取其悬液，用无菌水稀释至10^-5浓度，通过200 μL移液枪吸取稀释液均匀涂抹于滤纸培养基上，置于28 ℃培养箱中恒温培养4~6 d，挑选出在滤纸培养基上生长良好，且出现降解孔洞的真菌菌落，将其接种于PDA培养基上进行进一步的分离纯化。在无菌的条件下，选取生长快、长势好的菌株进行滤纸崩解测试，即在加有滤纸条 (1 cm×6 cm) 的赫奇逊氏无机盐培养基中，接入1 mL菌液 (空白组CK不接菌液) 在摇床转速80 r·min^-1，28 ℃的条件下恒温匀速震荡，培养4~6 d，观察滤纸条的断裂程度，从而判断相应菌株的降解效果。观察记录滤纸条崩解程度，选出较优菌株作为下一步复筛的目的菌株。

2.2.2 高产纤维素酶菌株复筛

在28 ℃无菌条件下，在刚果红培养基上点接初筛所获得的单菌株，置于28 ℃培养箱中恒温培养3~4 d，根据水解情况，筛选出水解圈明显且与菌落直径比值较大的目的菌株，将筛选后得到的目的菌株接种于PDA培养基斜面上培养3~5 d，4 ℃冰箱冷藏、备用。

2.2.3 高产纤维素酶菌株酶活测定

在无菌的条件下，将70 mL液体产酶培养基装入250 mL三角瓶中，并接入分离、筛选后得到的菌株，恒温振荡 (160 r·min^-1，28 ℃) 培养2~3 d。初酶液的提取方法：取20 mL的产酶培养液，离心 (4 000 r·min^-1，10 min)，取上清液，即为初酶液。用DNS法测得各酶液的光密度 (optical density, OD) 值，比对标准曲线^[17]，求得对应菌株的酶活性。DNS试剂法是在波长540 nm处有最大光吸收的条件下，一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈线性比例关系，利用比色法测定其还原糖生成量就可得到纤维素酶的活性的大小^[18]。酶活定义：在pH=5.0、50 ℃条件下，每1 mL初酶液在1 min内水解CMC-Na，生成1 μg的葡萄糖，称为一个CMC酶活力单位 (μg·min^-1)。将0.2 mL酶液及0.8 mL CMC-Na溶液 (溶于pH=4.8醋酸缓冲液中) 混合，在50 ℃中水浴30 min后加入1 mL DNS试剂，并于沸水浴中灭活5 min终止反应，再将其置于常温中水浴，以加快冷却至室温，最后加入8 mL蒸馏水稀释并在540 nm波长下测其OD值。OD值越大，说明该菌株的酶活性越强。

2.2.4 真菌菌落形态及生理生化测定

将复筛出的纤维素酶菌株点接种于PDA培养基中，在恒温28 ℃的条件下，培养1~2 d后取少量菌丝于显微镜下观察菌丝及孢子形态，培养2~3 d后观察菌落和菌种形态特征，并参照文献[19-20]对复筛产纤维素酶菌株形态特征进行初步鉴定。

2.2.5 目标菌株的18S rRNA序列鉴定

采用聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR) 测序法鉴定菌种18S rRNA序列^[21]，以通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG) 和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC) 为扩增引物。PCR反应条件：94 ℃ 33 s；72 ℃ 20 s；52 ℃ 30 s，33个循环。PCR产物经电泳检测合格后进行测序 (由上海博尚生物技术有限公司完成)，将所得序列通过Blast程序和GenBank核酸数据在美国国立生物技术信息中心 (National Center of Biotechnology Information, NCBI) 数据库比对分析。

3 结果与分析 3.1 高产纤维素酶菌株的初筛

取在PDA培养基上生长速度快且长势好的菌株，再接种到PDA培养基中进行分离纯化，最终得到78株真菌单菌株。将得到的78株菌株在无菌条件下的滤纸培养基培养，挑选出生长良好、且有降解孔洞出现的真菌菌落20株，接种于滤纸条液体培养基中，并设未接菌种的滤纸条液体培养基空白组作为对照 (CK)，恒温震荡 (120 r·min^-1，28 ℃) 条件下培养4 d，测其失重率，结果如表 1所示。以滤纸失重率>20%作为标准，将筛选出的菌株作为下一步复筛目的菌株，目的菌株有TB4、TB7、TB9、TB14、TB19、TB20。

3.2 高产纤维素酶菌株的复筛

在28 ℃无菌条件下，将目标菌株TB4、TB7、TB9、TB14、TB19、TB20，接种于刚果红培养基中培养5 d，观察水解圈出现的先后顺序、明显程度、水解圈直径与菌落直径的比值，结果如表 2所示。根据染色后的情况，选择水解圈首先出现且明显，同时与菌落直径比值大的作为下一步酶活测定实验的目的菌株，分别是TB4、TB7、TB19。

3.3 纤维素酶活性的测定

将经复筛后的菌株TB4、TB7、TB19制成菌悬液，接种到CMC-Na (pH值4.8) 液体培养基中，恒温震荡 (28 ℃，160 r·min^-1) 培养3 d后通过测定OD值判断CMC酶活性，结果如表 3所示，菌株TB4的酶活性最大。与另外两株真菌相比，TB4在滤纸失重率、水解圈出现顺序、水解圈直径与菌落直径比、酶活性都优于TB7、TB19，因此，TB4即为高产纤维素酶的目标菌株。

3.4 TB4菌株鉴定 3.4.1 TB4菌株形态鉴定

菌株TB4在PDA平板上培养2 d后，菌落呈白色绒毛状, 4 d后菌落颜色由白色变为蓝绿色，菌丝质地由绒毛状变为地毯状半绒，四周界限明显，绒毛状且无渗出液，中间褶皱凸起，类似同心圆 (图 1)。

TB4真菌菌丝体上具有横隔膜 (图 2)，菌丝上束生多枝分生孢子梗，子实体类似扫帚状，且每个分生孢子梗上均着生球状或卵圆形的分生孢子，单轮生，壁光滑。由菌产生的分生孢子卵形壁光滑，着生于菌丝上。根据TB4菌落形态及显微镜下的观察，结合参考文献，初步鉴定该菌株为青霉属 (Penicillium)。

3.4.2 TB4菌株分子生物学鉴定

将所测序列结果在NCBI上进行Blast软件比对，结果显示TB4菌株的18S rRNA基因序列与青霉属的小刺青霉 (Penicillium spinulosum) 的18S rRNA基因序列同源性高达99%，由此该真菌鉴定为小刺青霉。TB4菌株的18S rRNA序列长度为546 bp，全序列如下：

GGAACTGCACCTACCTGATCGAGGTCACCTGAAAGGATGATGGGTTGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAA AGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACTCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCGGGGGGACGGAGCCCAACACACAAGCC GTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATT CACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTT TAACTTATTTAGTTTATGCTCAGACTGCAATCTTCAGACAGAGTTCAATGGTGTCTCCGGTGCGCGCGGACCCGGGGGCAGAAGCC CCCCGGCGGCCGTGAGGCGGGCGCACCGAAGCAACAAGGTACAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTC AGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACAGAAG。

4 结论与讨论

从天宝岩国家级自然保护区采集样品，通过刚果红水解及滤纸崩解等多种实验方法综合应用，进而分离筛选出具有高产纤维素酶的菌株TB4。利用不同培养基对菌株进行多次分离、筛选，通过观察菌落形态和菌丝结构，精确对菌株种属进行初步鉴定，并用引物ITS1与ITS4扩增，通过18S rRNA基因序列在NCBI数据库中进行Blast软件分析比对确定TB4菌株为小刺青霉。由于倒木中菌种复杂且多样，在作滤纸崩解实验前将菌株接种在滤纸培养基中筛选，根据滤纸分解程度进行筛选，实验结果较为直观。刚果红培养基筛选法既可直接筛选出产纤维素酶的菌株，还可通过比较水解圈大小，大致判断出该菌株的产纤维素酶的能力，从而减少了筛选实验的工作量。通过CMC酶活性测定确定产酶最优的菌种为TB4，对比前人的实验结果^[23]，菌类混合实验能在一定程度上提高纤维素降解能力。

在长苞铁杉倒木分解过程中，小刺青霉高产分解纤维素酶加快倒木分解，倒木中的营养物质返还于自然环境，在维持天宝岩森林生态系统的平衡稳定及能量守恒过程中起到一定作用。由于只取一部分倒木边材进行实验，不同木材质地、腐朽程度、坡度、海拔等因素对菌类生长的影响还需进一步研究。通过对高产纤维素酶菌株鉴定及其酶活性检测展开研究，探讨分解菌对长苞铁杉倒木分解的影响，可为后期在长苞铁杉林内开展倒木动态分解过程研究提供一定科学依据和理论基础。