兰科植物全为珍稀濒危物种，皆列入《野生动植物濒危物种国际贸易公约 (CITES)》的保护范围，是植物保护中的“旗舰”类群^[1]。兰科植物在物种形成、系统进化、传粉生物学、园艺观赏、药用价值和香料利用等方面的研究都久负盛名^[2-3]。最新兰科分子系统划分为5亚科22族^[4]。其中，兰族有68个属2 000多种，为兰亚科物种最多样的族，广泛分布于新旧世界的北温带和热带地区^[5]。CHASE et al^[4]的分子系统学研究已取得显著进展，但亚族及一些大属的系统发育关系还未清楚，亚族的范围也不稳定。兰族以前的分子系统学研究仅采用单一的DNA分子标记^[6-9]，一些结论和结果的支持率很低，甚至没有统计支持，并且许多研究中的取样主要来自于地中海地区^[6-10]，许多分类的问题依旧没有解决。兰族在亚洲东部具有高度的多样性，然而许多类群，特别是那些单一种的属，很少被用于分子生物学研究中。此外，该族植物属间形态差异较小，各种性状往往相互交叉，属间界限难以区分。由于分子数据较少被应用和支持率低的原因，不同的学者和相关的著作中对于中国兰族属的界定存在较大的分歧。如《中国植物志》兰族部分主要参照Dressler的系统和属的概念，分子系统学的研究结果基本没有被采用，兰族被分为鸟足兰亚族、兰亚族和双袋兰亚族3个亚族21个属^[3]；《Flora of China》(第25卷) 在《中国植物志》的基础上，采用了分子系统学的部分研究成果对中国兰族属做出了界定，该族被分为23个属，但是早期的分子系统研究由于取样的问题，支持率较低，部分属间关系还尚未清楚^[11]；《中国生物物种名录》中关于兰族部分参考的分子系统较新，兰族被分为3个亚族23个属，但也同样存在支持率较低的问题^[12]。金伟涛等^[13]关于中国兰科属的界定中有分子系统学的研究，但其支持率不高。LI et al^[14]的研究将中国兰族分为2个亚族30个属。中国兰族属的界定存在较大的分歧，因此利用新的证据进一步开展中国兰族的系统发育研究无疑是该族重要的研究方向。

本研究对中国兰族进行全面系统的取样，利用分子标记，选取叶绿体基因rbcL、matK、trnL-F、psbA-trnH、trnS-trnG和核基因Xdh、ITS作为分子标记，旨在重新构建中国兰族的系统发育树，为中国兰族属间的界定提供分子水平上的证据。

1 研究方法 1.1 分子标记的选择和取样策略

中国兰族系统发育分子标记的选择参考JIN et al^[15]，TANG et al^[16]的研究成果。选取了叶绿体基因rbcL、matK、trnL-F、psbA-trnH、trnS-trnG和核基因Xdh、ITS作为分子标记。

对中国兰族植物的28属122种进行取样分析。基于前人^[15-16]对亚洲红门兰族和无柱兰群系的研究，采用Disa celata，D. cephalotes和D. caulescens作为外类群。其中8个样品Habenaria acuifera，H. balfouriana，H. leptoloba，H. petelotii，H. yuana，Neottianthe calcicola，Peristylus formosanus和Coeloglossum bracteatum来源于深圳兰科植物保护研究中心，其余类群的DNA序列来源于GenBank。

1.2 DNA的提取

采用改良CTAB法^[17]，从标本或经硅胶干燥的样品中提取样品DNA。

1.3 PCR扩增和测序

PCR扩增和测序引物见表 1。PCR的反应体系总体积30 μL，其中模板DNA 1 μL (10~50 ng)、2×Buffer缓冲15 μL、正反向引物各2、05 μL DNA聚合 (Mighty Amp Ⓡ DNA Polymerase Ver.2)，最后用去离子水补齐至30 μL。

PCR反应体系的扩增程序为：98 ℃预变性5 min，98 ℃变性16 s，50 ℃退火30 s (根据引物Tm值在45~58 ℃调整)，68 ℃延伸50~110 s (根据所扩增片段长短设置相应时间)，35个循环，68 ℃延伸8 min，然后终止反应。PCR扩增产物，跑胶。

PCR扩增产物直接送至华大基因研究中心进行回收，测序。

1.4 序列的比对和系统发育分析

测序结果用Seqman进行序列校对和拼接，利用MEGA 5.05中的Muscle对序列进行比对，比对后的矩阵进行手工调整，然后在CIPRES网站上进行最大似然法分析运算，得其系统进化关系。

2 结果与分析 2.1 序列特征

将5个叶绿体基因rbcL、matK、trnL-F、psbA-trnH、trnS-trnG和2个核基因Xdh、ITS比对校正后直接合并，排列后长度为6 782 bp，其中包括2 477个 (36.52%) 变异位点和1 525个 (24.49%) 简约信息位点 (表 2)。

2.2 系统发育分析

根据研究结果 (图 1)，将兰族分为26个分支，其中20个分支得到了高度的支持，6个分支具有中度支持率，属间的系统关系也得到了较好地解决。兰族中基于形态特征定义的一些属并不是单系，例如无柱兰属 (Amitostigma)、玉凤花属、舌喙兰属、角盘兰属、舌唇兰属、阔蕊兰属和小红门兰属。

Clade 1-7包括36种，其中大部分属于广义的无柱兰属，除此之外还有毛轴兰属、小红门兰属、兜被兰属 (Neottianthe)、长喙兰属 (Tsaiorchis) 和舌喙兰属各属的种类。Super Clade A很好地分成了7个分支，除Clade 7和Clade 5具中度支持率 (BP=66和BP=66)，其余的分支均具有很高的支持率。Clade 1包括了无柱兰属和小红门兰属9个种; Clade 2包括兜被兰属的2个种和无柱兰属的4个种; Clade3由来自无柱兰属的9个种组成; Clade 4由舌喙兰属 (5种)、无柱兰属 (1种)、小红门兰属 (1种)、长喙兰属 (1种) 和毛轴兰属 (1种) 组成; Clade 5由Tsaiorchis neottianthoides单种构成，具有中度支持率 (BP=66)；Clade 6由Amitostig mapinguicula单种构成，具有很强的支持率 (BP=100)；Clade 7由Sirindhornia pulchella单种构成，具有中度支持率 (BP=65)。

Clade 8-13包括32种，其中大多数都属于广义的舌唇兰属，除此之外还有来自角盘兰属、反唇兰属 (Smithorchis)、蜻蜓兰属 (Tulotis)、盔花兰属、凹舌兰、手参属、红门兰属各属的种。Clade 8内部之间的系统关系还未得到很好的解决。Clade 13是由Brachycorythis henryi组成的，具有100%的支持率。

Clade 14包括4个种，其中2个种来自兜蕊兰属，2个种来自孔唇兰属(Porolabium)。具有很高的支持率 (BP=100)。Clade 15由冷兰属 (Frigidorchis) 的一个种和高山兰 (Bhutanthera) 的一个种聚成单系。Clade 16是来自4个舌唇兰属的种类，聚为很好的一支 (BP=100)。Clade 17由3个来自角盘兰属的种类组成，具有很高的支持率 (BP=97)。Clade 18包括2个来自角盘兰属的种类和4个来自阔蕊兰属的种类。Clade 19由黄花小红门兰 (Ponerorchis chrysea) 一种组成，具有很高的支持率 (BP=100)。Clade 20包括8个种，其中一个来自白蝶兰属，其余均来自玉凤花属。Clade 21由来自阔蕊兰属的种类组成。Clade 22由7个玉凤花属的种类构成并具有很高的支持率。Clade 23由怒江兰属 (Nujiangia) 一个种组成，具有较高的支持率 (BP=84)。Clade 24由合柱兰属的一个种单独构成一支。

Clade 25由Satyrium nepalense，S. yunnanense和S. ciliatum组成，支持率很高。Clade 26由Disperis lindleyana，D. neilgherrensis和D. dicerochila聚成高度支持的单系支，二者位于系统的基部。

3 结论与讨论 3.1 无柱兰属、小红门兰属和兜被兰属的系统关系

无柱兰属、小红门兰属和兜被兰属聚为高度支持的单系 (Clade1-3)(BP=94)。这与LI et al^[14]，JIN et al^[15]的结果一致，且支持率 (BP=94) 远高于JIN et al^[15]的研究 (BP=66)，支持将无柱兰属和兜被兰属归并到小红门兰属。

3.2 长喙兰属、紫斑兰属和舌喙兰属的系统关系

紫斑兰属 (Hemipiliopsis)、舌喙兰属、Ponerorchis brevicalcarata和Amitostigma hemipilioides聚为高度支持的单系 (Clade 4)(BP=100)。长喙兰属作为Clade 4的姐妹类群，具有中度支持率 (BP=66)。建议将紫斑兰属、Ponerorchis brevicalcarata和Amitostigma hemipilioides并入舌喙兰属，而长喙兰属仍作为一个独立的属。

3.3 毛轴兰属与大花无柱兰的系统关系

大花无柱兰 (Amitostigma pinguiculum) 作为Clade1-5的姐妹类群具有100%的支持率，支持金伟涛等^[13]将该种单独成立一属，改名为时珍兰属。毛轴兰属作为Clade1-6的姐妹类群，具有中度支持率 (BP=65)，毛轴兰属仍作为一个独立的属。

3.4 舌唇兰属及其近缘属的系统关系

舌唇兰属分为亲缘关系较远的2支 (Clade 8与Clade 16)，分属于2个不同亚族——兰亚族和玉凤花亚族 (Habenariinae)，得到了很高的支持 (BP=99)。反唇兰属、蜻蜓兰属、尖药兰属 (Diphylax)、Herminium angustilabre和H. carnosilabre镶嵌在舌唇兰属，除反唇兰属的支持率较低外，其他的都具有很高的支持率。这与JIN et al^[15]研究一致，且支持率远高于JIN et al^[15]的研究。支持把反唇兰属、蜻蜓兰属与尖药兰属、H. angustilabre和H. carnosilabre归并到舌唇兰属 (Clade 8)。

盔花兰属 (Clade 9) 作为Clade 8的姐妹类群具有中度的支持率。

3.5 凹舌兰属、掌裂兰属和手参属的系统关系

凹舌兰属和掌裂兰属聚成一支单系 (BP=100)，凹舌兰属镶嵌分布在掌裂兰属中。根据二者的形态，将凹舌兰属归并到掌裂兰属。

手参属作为Clade 10的姐妹类群，与来自舌唇兰属的一个种类聚成一支单系支，具有中度的支持率。将Platanthera chlorantha归入手参属。

3.6 角盘兰属及其近缘属的系统关系

兜蕊兰属、角盘兰属、孔唇兰属嵌入到玉凤花亚族中，且角盘兰属不是单系。孔唇兰属与兜蕊兰属聚成一支高度支持的单系 (Clade 14)(BP=100)，二者镶嵌分布。研究结果与金伟涛等^[13]的研究一致，但其由于支持率低并未对这个类群的分类做出处理，该类群聚成高度支持的单系。因此，把兜蕊兰属、孔唇兰属、冷兰属、高山兰属以及一些错放于舌唇兰属的Platanthera latilabris，P. clavigera和阔蕊兰属的Peristylus elisabethae，P. forceps，P. mannii归并到角盘兰属。

黄花小红门兰作为角盘兰类群的姐妹类群，具有高的支持率 (BP=92)，同意金伟涛等^[13]将其单独成立为一个新属——先骕兰属。

3.7 玉凤花属及其近缘类群的系统关系

玉凤花属被分为2个类群 (Clade 20、Clade 22)。白蝶兰属的模式种与7个来自玉凤花属的种类构成具有高度支持率的单系 (Clade 20)；Clade 22由玉凤花属的7个种类组成与Clade 23、Clade 24聚成一支具有中度支持率的单系。

阔蕊兰属毫无疑问位于玉凤花亚族，成为玉凤花属其中一支的姐妹类群。在本研究中，狭义阔蕊兰属是很好的单系 (Clade 21)，具有较高的支持率 (BP=58)。

根据研究结果，把Clade 20的玉凤花属的种类归入白蝶兰属，而Clade 22仍作为玉凤花属，保留阔蕊兰属、怒江兰属和合柱兰属。

4 结论

中国兰族的系统发育树显示中国兰族由鸟足兰亚族、双袋兰亚族和兰亚族3个亚族组成，包含19个属。其中鸟足兰亚族和双袋兰亚族分别仅由单属鸟足兰属和双袋兰属组成，位于系统的基部。兰亚族包括小红门兰属、毛轴兰属、盔花兰属、红门兰属、舌唇兰、时珍兰属、掌裂兰属、角盘兰属、Gnennaria、先骕兰属、舌喙兰属、苞叶兰属、合柱兰属、手参属、玉凤花属、白蝶兰属、阔蕊兰属17个属。

根据研究结果，建议将无柱兰属、长喙兰属和兜被兰属归并到小红门兰属；紫斑兰属、Ponerorchis brevicalcarata和Amitostigma hemipilioides并入舌喙兰属；反唇兰属、蜻蜓兰属与尖药兰属、Herminium angustilabre和H. carnosilabre归并到舌唇兰属；将凹舌兰属归并到掌裂兰属；把兜蕊兰属、孔唇兰属、冷兰属、高山兰属以及一些错放于舌唇兰属的Platanthera latilabris，P. clavigera和阔蕊兰属的Peristylus elisabethae，P. forceps，P. mannii归并到角盘兰属；将Clade 20的玉凤花属的种类归入白蝶兰属，而Clade 22仍作为玉凤花属。支持毛轴兰属仍作为一个独立的属，黄花小红门兰单独成立新属——先骕兰属。